人巨细胞病毒UL128趋化因子功能鉴定及其致病机制研究

先天性耳聋是最常见的出生缺陷，HCMV是导致感染性先天性耳聋最主要的病原体，但其致聋机制尚不明确。研究表明GPCMVβ-趋化因子在病毒相关性耳聋发病中起重要作用。HCMV UL128具有β-趋化因子结构特征，但尚无功能鉴定及在先天性耳聋中致病作用的报道。我们的预实验显示，转染UL128表达载体的细胞培养上清对PBMC有明显趋化作用。本项目拟在此基础上，首先构建UL128重组蛋白的稳转细胞表达体系；然后从结合趋化因子受体、激活信号转导通路、体外趋化人PBMC及对PBMC凋亡和胞内钙离子浓度的影响等方面鉴定UL128的趋化因子功能；进一步用UL128高表达和抑制表达的HCMV分别感染人内耳感觉上皮和PBMC共培养模型，研究两者在致细胞炎症反应上的差异，揭示UL128在HCMV相关性耳聋发病机制中的作用。本项目将为深入探索HCMV相关性耳聋的发病机制提供新思路，为抗HCMV药物研发提供新靶标。

本项目如期、圆满完成所有研究计划，取得下列研究成果：(1) 成功构建UL128重组蛋白（rUL128）真核表达系统，纯化获得分子量约为26KD的rUL128，浓缩得到浓度为0.1mg/ml的目的蛋白，实现HCMV UL128基因体外高效、稳定的表达；(2) 体外趋化试验证实rUL128（100ng/ml）具有与人β-趋化因子相似的趋化PBMC的作用，且无明显浓度依赖性，免疫组化结果显示rUL128具有结合PBMC胞膜受体的功能，浓度为50ng/ml和100ng/ml的rUL128均可使PBMC胞内Ca2+浓度呈现短暂升高，rUL128蛋白具有活化PBMC的功能；(3) 成功分离获得耳蜗感觉上皮细胞及原始祖细胞，成功构建HCMV感染耳蜗上皮细胞模型；(4) HCMV野生病毒株感染组织细胞与PBMC共培养体系，致共培养上清炎症因子IL-6、TNF-α释放明显增加，且IL-6的表达具有时间累积效应，RNA干扰获得的UL128缺陷病毒株致PBMC炎症因子释放能力明显削弱。本项目已发表SCI收录论文3篇和中文综述1篇，参加全国性学术会议并在会上作口头报告2次，培养博士研究生1名。