痤疮丙酸杆菌预防胸膜肺炎放线杆菌感染的体液免疫机制

猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)是严重危害养猪业的呼吸道致病菌，目前尚无可交叉保护的商品化疫苗。本课题组在前期研究中，意外发现痤疮丙酸杆菌（PA）具有预防APP感染的作用（已获专利）。为系统研究其作用机制，促进这一新型疫苗的研究，本课题拟以PA诱导的体液免疫应答为中心，阐明PA免疫应答抗体的种类、水平与抗APP感染效果的相关性，建立免疫细胞损耗动物模型，分析PA抗体在抗APP感染中的作用及方式。分离鉴定PA的免疫保护性抗原蛋白，利用重叠肽库技术和Elispot技术筛选保护性蛋白的记忆性B细胞表位，合成串联表位短肽，免疫动物，检测免疫效果和抗感染能力，确定PA抗APP感染的最小功能肽，综合数据初步阐明PA预防猪传染性胸膜肺炎发生的作用机制。为猪传染性胸膜肺炎的药物研究及疫苗研究提供十分有益的基础，这一成果完全属于自主研究，拥有自主知识产权，必将为全球APP疫苗的研究带来新的思路和方法。

猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种高度接触传染性、致死性呼吸道疾病，近年来常与其他猪病发生混合感染，给世界各养猪国家带来了巨大的经济损失。该病病原血清型多，且主要血清型间缺乏交叉免疫保护，导致尚无广谱的商品化疫苗出现。我们在前期研究中意外发现痤疮丙酸杆菌（PA）具有预防APP感染的作用，为阐明PA预防APP感染的免疫学机制，本项目以免疫原性良好的PA14菌株免疫小鼠，首免后第35天用APP攻毒，保护率为100%，存活率与外周血中抗PA 的IgG水平存在极其显著的正相关。抗PA抗体转移实验证明，PA抗体可抵抗10倍LD50的APP血清1型或5型攻击，存活率均为100％。抗PA IgG能够显著促进巨噬细胞对APP的吞噬（P<0.01），其促吞噬效果与抗APP特异性IgG的作用相似（P>0.05）。建立小鼠B细胞损耗模型、中性粒细胞损耗模型、吞噬细胞损耗模型，证明小鼠B细胞损耗后，抗PA抗体水平显著下降，保护率也极显著降低；中性粒细胞减少的小鼠在接受抗PA抗体后，与正常的小鼠相比无明显差异，仍能有效清除肺部细菌且肺部病理损伤程度减轻；而巨噬细胞损耗的小鼠，不论是否给予抗体，均不能有效对抗APP的感染，表明抗PA特异性抗体抗APP感染必须依赖巨噬细胞。.利用感染仔猪抗APP的高效价抗体，通过2D电泳和质谱分析技术，噬菌体展示肽库技术和DNA测序技术，筛选并鉴定了16个PA与APP的交叉抗原蛋白。蛋白Ssb与猪抗APP抗体结合效果最好，对APP1和APP5保护率分别为80%和60%。交叉抗原经同源性分析和猪B细胞表位检测，共获得8个短肽，其中Ba1、Bb5、C1单独免疫能够引起IL-4水平的显著升高（P<0.05），仅Bb5（450pg/ml）能够引起IFN-γ水平的显著升高，而Ba1、C1倾向于Th2免疫应答，多肽Ba1和Bb5显著提高对小鼠的保护效果（P<0.05），均为80%，C1存活率为60%，Ba1及Bb5多肽联合免疫后分别用APP1及APP5攻毒，存活率均显著提高，分别为80%（P<0.05）及90%（P<0.01）。.本研究阐明PA 免疫后诱导的体液免疫可以抵抗APP感染，B细胞和巨噬细胞在免疫预防中起着重要作用。获得的交叉抗原肽为预防多种血清型APP感染的多肽疫苗研究提供了重要潜在候选抗原。