猪胸膜肺炎放线杆菌znuA基因致病机理的研究

猪胸膜肺炎放线杆菌是目前危害养猪业的一种重要病原，其致病机制的研究是预防和控制猪胸膜肺炎的关键之一。前期研究结果表明，在猪胸膜肺炎放线杆菌中存在znuA基因，且在免疫蛋白质组学研究中发现ZnuA蛋白具有较强的免疫原性，然而znuA基因在猪胸膜肺炎放线杆菌中的致病机制尚不清楚。本项目拟通过构建猪胸膜肺炎放线杆菌znuA基因的缺失突变体，通过粘附、侵入宿主细胞实验、吞噬实验以及动物实验（检测诱导宿主炎性因子、临床症状、病理变化等）从体内、体外水平解释znuA基因致病机理。同时通过基因组表达谱芯片技术和比较蛋白质组学技术进行突变株和亲本株表达谱的研究，分析znuA 基因缺失后影响了哪些基因和蛋白的表达，并通过生物信息学方法分析受影响的基因和蛋白与毒力的关系，从而阐明znuA基因的致病机理，为系统地研究猪胸膜肺炎放线杆菌的致病机制奠定基础。

胸膜肺炎放线杆菌（APP）是当前严重危害养猪业的一种重要病原菌。锌在许多酶中发挥了重要的催化作用，而在反转录和复制因子中则发挥了重要的结构作用。ZnuABC高亲和锌离子摄取系统属于ATP结合转运子系统，能获得足够的锌，该系统由三个蛋白组成：ZnuA、 ZnuB和ZnuC。ZnuA是可溶的周质金属伴侣蛋白，它能有效的捕获并结合细胞间隙里的锌并将其运送至ZnuABC转动系统的跨膜部件。znuA基因是APP的毒力基因。本项目通过构建znuA基因缺失突变株，体外研究了其生物学特性，进一步利用基因表达谱芯片，结合生物信息学分析，筛选毒力相关差异表达基因并利用荧光定量PCR验证。对可能直接调控毒力相关基因开展致病性分析。通过项目三年的执行，获得了胸膜肺炎放线杆菌znuA基因突变株和互补菌株，通过突变株对细胞黏附、侵染、吞噬、中性粒细胞杀伤试验及对动物（小鼠和仔猪）毒力试验等证实了znuA基因的缺失导致了APP致病力降低。将突变株和野生菌株进行了基因表达谱芯片分析，挑取了6个明显差异表达基因使用荧光定量PCR进行了验证，发现其中4个基因（pgaA、pgaB、pgaC、pgaD）表达明显下降并与细胞粘附和生物被摸合成相关。通过本项目的研究，初步阐明了胸膜肺炎放线杆菌ZnuA是通过与生物被膜合成相关的重要毒力因子pgaA、pgaB、pgaC、pgaD来影响APP的致病性的分子机理，为后续深入研制APP活疫苗提供了基础和新的思路。项目完成后，文章修回1篇，申请国家发明专利1项，培养在读研究生2名。