诱导肾小管上皮细胞自噬通过下调TLR4/NF-kB通路对移植肾IRI保护机制的研究

Ischemia-reperfusion injury (IRI) of graft kidney is the major cause for delayed graft function(DGF) and for early graft failure. Currently, studies have suggested that the extent of damage is closely related to the level of autophagy in renal tubular epithelial cells. Furthermore, the aggravated IRI was observed in autophagy-deficient mice. The analysis of the data from protein chip demonstrated that autophagy selectively down-regulates TLR signal pathway and TLR4/NF-КB pathway participated in the introduction of IRI. Therefore, we hypothesize that the increased activity of autophagy in renal tubular epithelial cells could protect the graft kidney from IRI. In order to clarify the accurate role of autophagy in transplanted kidney, we are going to apply Tat-Beclin 1, a strong autophagy-inducing agent, to mouse models with IRI, to detect the autophagic body via electron microscopy and to evaluate the level of IRI by using various parameters. And the increased autophagy further regulate the expression of TLR4 in human renal tubular epithelial cells by control variable method to verifying the key role of autophagy in graft IRI by down-regulating TLR4/NF-КB pathway. This project aims to clarify the molecular mechanism of autophagy in the process of ischemia-reperfusion injury in graft kidney and to provide the new theoretical basis to the prevention and therapy of DGF following kidney transplantation.

供肾缺血再灌注损伤（IRI）是造成原发性移植肾功能延迟恢复（DGF）以及早期移植失败的主要原因。研究发现IRI程度与肾小管上皮细胞的自噬密切相关、自噬相关基因缺陷的小鼠肾脏IRI中损伤加重；自噬能够选择性下调TLR信号通路，且TLR4/NF-КB通路参与介导移植肾IRI。因此我们推测移植肾肾小管上皮细胞自噬水平的上调可能会减轻供肾IRI程度，其机制可能是自噬选择性下调TLR4/NF-КB通路。本课题拟在小鼠肾移植模型中应用Tat-Beclin 1诱导自噬，动物实验及体外实验中通过对自噬的监测和移植肾IRI程度的形态学及功能评价以明确其通过增加肾小管上皮细胞的自噬活动起保护作用，并进一步在人肾小管上皮细胞中以控制变量法调节TLR4表达，验证细胞自噬下调TLR4/NF-КB通路在移植肾IRI保护中存在关键调控作用。旨在阐明自噬在移植肾IRI发生及修复的分子机制，为DGF防治提供新的理论依据。

本课题对肾IRI机制进行深入探索，为移植肾DGF的防治提供理论依据，对提高移植肾近、远期存活率都具有重大的指导意义。线粒体与肾小管的功能密切相关，线粒体自噬又决定着线粒体的 “存亡”，当肾脏经历严重、持续的缺氧缺血后，线粒体供能减少，内质网功能受到影响，无法正确折叠蛋白质，而再灌注期内质网应激增强，使得内质网腔内积聚大量的异常折叠或未折叠蛋白质，同时线粒体产生大量活性氧，细胞损伤进一步加重。当内质网腔内出现异常蛋白质时，内质网感受器激活，启动应激通路，促进下游因子表达，发生未折叠蛋白反应（UPR）；其中xbp1是UPR中非常重要的转录因子，与细胞死亡密切相关；传统观念认为，UPR是机体应对外界应激所产生的保护性措施，但是过度的URP反而启动细胞的凋亡程序，在此过程中发生强烈的炎症反应，其中NLRP3炎症小体表达明显增多；我们的研究明确了nlrp3能够与线粒体共定位，加重线粒体的损伤，有文献报道，xbp1能够上调NLRP3的活化，促进炎症的发生发展。因此，本课题通过培育xbp1半敲除小鼠进行体内实验，明确IRI后xbp1表达的减少如何对炎症和线粒体自噬产生影响，同时培养鼠肾小管上皮细胞TCMK进行体外实验模拟体内缺血再灌注过程，以此进行机制的探讨，我们的研究发现，下调xbp1的表达后，如果肾脏经过重度IR，能够减少NLRP3炎症小体的产生，抑制了Parkin的降解，增强线粒体自噬，从而清除受损线粒体，减少线粒体所释放的mtROS, 即清除了炎症小体的激活信号，抑制了炎症小体的活化，进而中断炎症小体与受损线粒体之间的正反馈调节以及细胞凋亡级联反应，最终减少细胞凋亡，减轻缺血再灌注肾脏的炎症反应和损伤程度，保护肾功能。.由此可知，机体产生的保护机制也是有其极限，不可一味的激活抑或抑制，我们的课题能够为减轻移植肾缺血再灌注损伤提供一个新的契机，使科研成果为临床问题的解决指明方向。