肾内RAS诱导肾小管上皮细胞自噬流障碍致缺血性急性肾损伤的机制研究

The exact roles of intrarenal angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) in ischemic acute kidney injury (AKI) remain elusive. Our preliminary study has demonstrated that abnormal activation of intrarenal renin-angiotensin system (RAS) is associated with the incidence of ischemic AKI. Preliminary experiment revealed that Ang Ⅱ could accelerate the formation of autophagic vacuole of HK-2 cells and provoke the dysfunction of eliminating autophagic vacuole via V-ATPase. It is hypothesized that abnormal activation of intrarenal RAS may occur after ischemia. Ang Ⅱ is able to influence lysosome acidification and maturation by inhibiting the function of lysosome V-ATPase pathway, leading to impairment of autophagy flux of renal tubular epithelial cells (RTECs), which is considered as a vital pathogenesis underlying ischemic AKI. In this study, cell and animal experiments will be conducted to investigate whether V-ATPase is a key target molecule of Ang Ⅱ-inducing impairment of autophagy flux of RTECs and whether impairment of autophagy flux can be attenuated and renal function can be protected by regulating intrarenal RAS or V-ATPase by using immunofluorescence, transient plasmid transfection and mRFP-GFP-LC3 methods, etc. These findings can provide potential target and theoretical basis for clinical treatment of ischemic AKI.

肾脏局部血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）参与缺血性急性肾损伤（AKI）发病的机制尚未阐明。我们前期研究证明，肾内肾素-血管紧张素系统（RAS）异常激活与缺血性AKI发病有关。同时预实验示，Ang Ⅱ促进HK-2细胞自噬泡形成，引起自噬泡清除障碍，可能通过V-ATPase介导。据此提出假说：缺血打击后肾内RAS异常激活，Ang Ⅱ通过抑制肾小管上皮细胞（RTECs）溶酶体V-ATPase功能，影响溶酶体正常酸化、成熟，引起自噬泡清除障碍，诱导RTECs自噬流障碍，是缺血性AKI的重要发病机制。本研究将通过细胞和动物模型，采用免疫荧光、质粒瞬时转染、自噬双标腺病毒感染等手段，旨在回答V-ATPase是否为Ang Ⅱ诱导RTECs自噬性降解受抑的关键分子，通过抑制肾内RAS异常激活、上调V-ATPase能否改善自噬流障碍，保护肾功能这一关键科学问题。研究将为缺血性AKI的治疗提供潜在靶点和科学依据。

急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是临床常见的急危重症，以多种病因造成肾功能短期内急性减退为特征，其发病率高，危害大。对其发病机制进行深入研究，有助于AKI防治水平的提高。我们通过构建缺血性AKI大鼠模型，研究肾内RAS激活与肾损伤之间的关系，验证氯沙坦具有减轻缺血再灌注（I/R）处理后肾损伤作用，并通过高通量测序、生信分析和RT-PCR等手段探索差异表达的circRNA及信号通路。利用缺血性AKI大鼠模型进一步筛选出与缺血性AKI发病相关的circRNA，并通过WB、RT-PCR、流式细胞仪检测凋亡及TUNEL等手段，确定circ-ZNF609与缺血性AKI发病相关。接着，通过OGD/R诱导及过表达/干扰circ-ZNF609验证其对肾小管上皮细胞自噬及损伤的影响。最后通过生信分析circ-ZNF609的结构特点，探索其可能发挥生物学功能的作用机制，验证circ-ZNF609与自噬相关信号通路PI3K-AKT之间的作用关系。此外，我们还从临床角度验证circ-ZNF609作为缺血性AKI新生物标志物的能力，并探究新型生物标志物uMMP-7对缺血性AKI发病的诊断效能和影响uNAG、sCys C等AKI传统生物标志物诊断精确性的因素及其合理应用策略。氯沙坦预处理可有效降低I/R处理后的缺血性AKI大鼠的血浆尿素、肌酐和细胞凋亡水平，改善肾小管结构肿胀、破坏等状态，进一步高通量测序及生物信息学分析发现大量差异表达的circRNA/mRNA，并且circ-ZNF609高表达与自噬相关的PI3K-AKT信号通路激活密切相关。通过临床验证发现uMMP-7是预测心脏手术后患者发生重度AKI和住院期间不良预后的早期生物标志物，并且uMMP-7预测儿童和成人严重AKI的AUC是0.81和0.76，优于uIL-18、uAGT、uNGAL、uACR和临床模型，同时改善了临床模型的风险再分类能力。此外，还发现甲状腺功能、血糖和外源激素对sCysC诊断重症患者AKI的准确性没有影响，并且血糖对uNAG诊断重症患者AKI的准确性也没有影响，优化了sCysC和uNAG的临床应用。研究结果将为确立缺血性AKI的新生物标志物及新治疗靶点提供更充分的科学依据，对进一步阐明缺血性AKI的发病机制，提高缺血性AKI临床防治水平有重要的科学价值。