解析花生突变体中唑嘧磺草胺和双氟磺草胺除草剂非靶点抗性形成的机制

The development of the effective and efficient cropping systems is reliant on the creation of a variety of crop species with different modes of resistance to many different types of herbicides. At present, much is known about target-site resistance to herbicides in crops, whereas the non-target-site resistance remains largely uninvestigated and is most likely an underrated issue. In the previous studies, we have generated a peanut (Arachis hypogaea) mutant with non-target resistance to the herbicides flumetsulam and florasulam through creating and screening a large ethyl methanesulfonate-mutated peanut population. The present project is intended to dissect the biochemical and molecular mechanisms underlying the non-target resistance in this mutant. Our study mainly focuses on: (1) determining the differences in uptake and degradation rates of flumetsulam and florasulam between the wild type and mutant plants; (2) defining the relationship between the degradation rates of these two herbicides and the activities of cytochrome P450 enzymes; (3) investigating the relation of the non-target resistance to the transcriptional regulation of cytochrome P450 and other genes; (4) identifying the mutations governing the herbicide resistance through bulked segregant analysis and whole genome sequencing (BSA-seq); and (5) assessing the correlation between the gene mutation(s) and the herbicide resistance. The results generated from the above studies are anticipated to be helpful in promoting research and development of herbicide-resistant traits in peanut and even other crop species.

创制对不同类别除草剂具有多种抗性机制的作物新品种是建立高效作物耕作体系的基础。目前，人们对农作物中的除草剂靶点抗性有较深入了解，而对非靶点抗性却知之甚少，其重要性有可能被严重低估。我们在前期研究中通过构建与筛选花生甲基磺酸乙酯诱变群体，获得了一个对唑嘧磺草胺和双氟磺草胺除草剂产生非靶点抗性的突变体。本项目拟剖析突变体中非靶点抗性形成的生化与分子机制。主要研究内容为：(1)突变体与野生型中唑嘧磺草胺和双氟磺草胺除草剂的吸收速率与降解速率的差异分析；(2)唑嘧磺草胺和双氟磺草胺降解速率与细胞色素P450酶活性的关系解析；(3)非靶点抗性与细胞色素P450基因和其它基因表达的关系探究；(4)混合群体分离分析法结合基因组深度测序(BSA-seq)挖掘与除草剂抗性相关的基因突变位点；(5)基因突变位点与除草剂抗性的关联性验证。研究结果将有助于促进花生甚至其它作物除草剂抗性性状的开发利用。

培育耐除草剂作物是高效农业生产的一个前提。我们从EMS诱变群体中筛选获得了一个耐唑嘧磺草胺和双氟磺草胺的花生突变体，本研究对其耐性机制进行了解析，主要结果及其意义陈述如下：.(1)突变体的除草剂耐性性状具有遗传稳定性，且该性状不对产量和品质产生负面效应，因此其具有开发利用价值。.(2)突变体的除草剂耐性是由非靶标抗性机制所致，这是因为除草剂靶标酶（乙酰羟酸合酶）的氨基酸序列及其基因在不同时期、不同组织中的表达量，均未改变，表明除草剂耐性不是由靶标抗性所致。.(3)突变体与野生型在转录水平上对除草剂的响应差异非常明显，数千个差异表达基因上调或下调，其中含37个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UGT），162个细胞色素P450单加氧酶，28个ABC转运体。这些结果说明，突变体中某些关键基因发生了突变，从而导致基因表达的大幅变化。.(4)为了揭示细胞色素P450在除草剂耐性形成中的作用，我们比较分析了突变体与野生型对三种细胞色素P450抑制剂（胡椒基丁醚、马拉硫磷与3-氨基-1，2，4-三唑）的响应，发现它们不能明显降低突变体的除草剂耐性。另外，对5个差异表达的CYP450基因进行异源表达，发现单一CYP450基因不能显著提高拟南芥的耐除草剂能力。目前尚缺乏证据证明花生CYP450基因在除草剂解毒中的作用。.(5)三个差异表达的UGTs基因（ENIS4M、E3VS3U和WIN7QF）的异源表达显示，它们能在不同程度上增强拟南芥对双氟磺草胺除草剂的耐受性，因此推测这类基因可能参与植物对双氟磺草胺除草剂的解毒过程，这有助于进一步完善人们对除草剂非靶点抗性机制的认知。.(6)F2代分离群体的遗传分析结果表明，突变体的耐除草剂性状可能由一个半显性基因控制。进而，用BSA-seq分析筛选出14个可能与除草剂耐性相关的候选基因，并对其中的LOC112707280基因的突变位点进行了验证，发现其变异位点与除草剂耐性相关联，但该基因的真实功能尚需探究。.(7)另一个重要发现是，耐除草剂突变体还具有很强的耐盐性，这一发现可为未来耐盐作物种质的创制与筛选提供一个全新的视角与策略。