M2c巨噬细胞诱导的Breg对小鼠肾移植免疫耐受的作用及分子机制研究

M2c macrophages(M2c) and regulatory B cells(Breg) play important roles in induction of transplant immune tolerance. However, the mechanism is not clear. Our recent researches discovered that only M2c could promote B lymphocyte to secret IL-10 and the IL-10+ cell expressed high CD5 and CD1d, which were consistent with CD19+CD5+CD1dhiIL-10+Breg cells. We found similar phenomenon between allogenetic M2c and B lymphocyte . In vivo, we transfused M2c to skin transplant mice and acquired lymph nodes in which we also found enhanced Breg cells. Meanwhile， we found that this kinds of B reg showed high Ca2+ concentration in cytoplasm. Therefore, we propose a hypothesis: M2c can enhance B reg proportion that can induce Treg and suppress immune response. In order to verify the hypothesis, we designed the program that utilized cell culture and renal transplant models of CD11b-DTR transgenic mice and mice with specific deletions of the STIM genes in B cells to reveal mechanism of M2c inducing Breg, especially calcium signaling pathways STIM-SOCE-calcineurin/NFAT, and explore the role of M2c in specific immune tolerance. These will provide new orientation for transplant immune tolerance.

M2c巨噬细胞（M2c）及调节性B细胞（Breg）在移植免疫耐受中发挥重要作用，但其诱导免疫耐受的机制尚不清楚。我们近期研究发现只有M2c促进B淋巴细胞IL-10的分泌，且高表达CD5、CD1d分子,即转化为免疫抑制性的CD19+CD5+CD1dhiIL-10+Breg表型。M2c这种调节作用同样存在于异体细胞之间。小鼠皮肤移植研究发现，M2c显著提高淋巴结内Breg比例，且B淋巴细胞内的Ca2+浓度显著增加。由此我们提出假说，M2c促进Breg生成发挥免疫抑制作用。为了验证本假说，采用细胞培养以及CD11b-DTR转基因小鼠、NFAT及STIM基因缺陷小鼠等移植动物模型，揭示M2c诱导Breg生成机制，特别是钙离子信号通路STIM-SOCE-calcineurin/NFAT在M2c与Breg和Treg之间的相互作用，明晰M2c特异性免疫耐受的作用，为肾移植的免疫耐受诱导机制提供新的思路。

主要进行了以下几方面的工作:.1.成功分离、纯化及诱导骨髓、腹腔和脾脏来源的巨噬细胞，并比较了不同来源不同极化状态下的巨噬细胞特性，在小鼠皮肤移植模型取得了验证。小鼠肾脏及心脏移植模型的深入验证并取得了部分结果；.2.成功利用骨髓巨噬细胞系RAW264.7诱导为M2c巨噬细胞，并利用RAW264.7巨噬细胞系成功诱导Breg细胞，节约了Breg诱导所需时间，提升了Breg诱导效率，为大量生成Breg输注在移植模型实验的验证奠定了良好的实验基础；. 3.采用生物信息学方法，分析Breg细胞生成所涉的关键信号通路并确定了一些枢纽基因，在该项目立论依据中的科学假说基础上，进一步为Breg生成的机制研究提供了更多的理论参考，相关的实验验证正在进行中；.4.在M2c研究过程中，我们欣喜的发现IL-10/TGF-β诱导的M2c型巨噬细胞可通过通过抑制小管细胞凋亡、炎症细胞浸润及促进小管细胞增殖等对肾缺血再灌注损伤发挥保护作用。M2c巨噬细胞输注可为移植肾缺血再灌注损伤提供新的治疗策略，在我国开展公民逝世后器官捐献与移植的重要阶段，为器官捐献者器官功能有效维护、降低术后DGF、排斥反应具有重要的潜在应用前景；. 5.该项目的开展过程中，因机体免疫网络系统中T、B、巨噬细胞各有重要作用，临床肾移植受者免疫状态的评价尚不精细，而受者外周血TCR-CDR3表达谱的变化能够客观反映T细胞的活化状态，故衍伸性开展了高通量精准化的临床肾移植受者TCR3免疫状态监测，指导受者合理应用免疫抑制剂以便于为下一步深入探究T、B、巨噬细胞相互关系奠定科学基础，可望成为提高肾移植人/肾长期存活的一种免疫状态监测新方法。