外周血干细胞生物学特性及其复合仿生支架修复关节软骨缺损的实验研究

Ideas of this study derived from successful clinical knee trochlea cartilage repair with directly transplanted patient's autologous peripheral blood mesenchymal stem cells (PB-MSCs) covered with autologous periosteum. The PB-MSCs could be obtained with minimally hurt,not special instruments needed and it also has the advantage of legally clinical application.This research will do comparative study on the biological characteristics of the PB-MSCs and the bone marrow derived MSCs,try to demonstrate the PB-MSCs could be used as seeded cells for cartilage repair. 3D porous demineralized cancellous bone and RGD poly peptide modifyed polypeptide/polysaccharides composite scaffolds will be used to make different biomimetic scafflods. The microenvironments' influence of the ECM,the biologically active demineralized cancellous bone scaffold, and the cartilage injury site on the different tissue engineered cartilage schemes will be investigated. Try to find if these microenvironments could promote the whole process of injuryed cartilage repair by implanting undifferentiated MSCs. At the same time, effects of different scaffolds on the cartilage repair will also be studied. This study has the advantage of research on better tissue engineered cartilage schemes combining new seeded cells,biomimetic scaffolds and microenvironments , it's also convenient for clinical translation.

受直接移植自体外周血MSCs（PB-MSCs）修复运动员软骨缺损成功并在兔膝关节得到验证启发，考虑到PB-MSCs具有获取损伤小、硬件要求低和临床合法性好的优势，本研究对外周血和骨髓源MSCs的生物学特性进行比较，试图证明PB-MSCs可做为新种子细胞用于软骨损伤修复。采用三维多孔脱钙松质骨和RGD多肽修饰聚氨基酸/多糖复合水凝胶支架制备不同的仿生软骨支架材料。通过研究细胞外基质（ECM）微环境、生物活性脱矿松质骨支架微环境和软骨损伤区微环境对不同组织工程软骨方案效果的影响，以及这些微环境是否足以促成植入的未诱导分化的MSCs对软骨损伤的修复全过程，同时研究不同支架对软骨修复效果的影响。辅以Y性染色体探针原位杂交和基因芯片检测基因差异性表达，研究新生的修复组织是否来自植入的MSCs。本研究有利于探索新种子细胞、仿生支架和微环境相结合的更佳的组织工程软骨方案的研究，更利于研究结果的临床转化。

软骨损伤是极其常见的关节病损。目前组织工程软骨常用的的种子细胞主要可分为软骨细胞和骨髓MSCs。软骨细胞体外扩增容易发生去分化，胚胎MSC存在伦理问题、致瘤性，常见的骨髓以及脂肪来源的MSCs由于数量少，体外扩增容易衰老以及取材需要创伤较大的操作的缺点。此外，单纯的细胞治疗存在以下的缺点：移植细胞的大片死亡、移植有效率极低和细胞容易失去调控等限制了其在软骨修复研究中的应用。 结合本课题组在2010年成功解决了PB-MSCs分离、培养和扩增的难题，为组织工程提供了一种新型的种子细胞，为后续研究奠定了基础。为了均匀的将PB-MSCs种植在组织工程支架中，本课题尝试应用PB-MSCs作为种子细胞，采用静滴法、注射法、离心法、负压法进行接种，最终确定离心法作为构建组织工程软骨的最佳接种种子细胞接种方式。为了深入了解PB-MSCs的生物学特性进行深入研究，我们通过以脱矿松质骨（DCB）为3D支架，复合外周血间充质干细胞（PB-MSCs）后，对PB-MSCs在支架上的存活，增殖，以及成软骨分化进行分析，并与BM-MSCs和软骨细胞进行比较。发现PB-MSCs具有与BM-MSCs相似的体外生物学特性，在3D支架中培养具有良好的成软骨分化能力，其透明软骨样基质分泌能力类似P1代软骨细胞。由于水凝胶不能提供满意的机械强度，而机械强度满意的水凝胶又不能提供最优的种子细胞生长和分化环境。我们在原来水凝胶的基础上，应用低温3D打印技术，使用PLGA复合NACL颗粒作为打印材料，设计制造出具有3D打印PLGA/NACL固相支架。体外理化表征和力学检测发现，改支架良好生物力学特性以及生物相容性。此外，我们通过在水凝胶中混入KGN（具有强力成软骨诱导能力的小分子），构建具有持续缓释作用的成软骨水凝胶体系，并通过与PLGA/NACL3D打印支架组合，形成双相支架（PLGA-PEG-PLGA水凝胶-KGN/PLGA 3D打印生物支架），既能为软骨修复提供良好的种子细胞微环境，又能提供优越的机械强度。通过体外理化表征和生物学检测以及体内植入软骨修复分析，该双向支架具有优越的生物相容性，成软骨诱导能力以及体内软骨修复能力的分析。复合有KGN的水凝胶增强PB-MSCs的成软骨分化能力，双向支架体系明显增强了组织工程支架的生物力学强度。体内植入半年后支架被完全吸收，软骨缺损区填充组织有蛋白多糖和胶原表达，形