震荡流活化TLR2-TAK1-IKK1-3致支架内再狭窄的机制研究

Abnormal endothelial shear stress (ESS) caused by oscillatory flow resulting in plaque rupture or erosion and thrombosis formation is one of the underlying mechanism of acute coronary syndrome (ACS) with high mortality. Toll like receptor2 (TLR2) is involved in development of plaque erosive and vulnerable plaques, whereas little is known about its relationship with ISR. TAK1 is one of key molecules in the TLR2 pathway. The mechanism of high rate of restenosis (ISR) at the side branch (SB) ostium after drug eluting stents implantation was still unclear. Our previous studies reveal abnormal ESS distribution of SB was relevant to ISR. A pilot study found abnormal ESS with oscillatory blood flow induced TLR2-inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase (IKK1-3), thus leading to enhanced JNK, p38 and activator protein (AP)-1. Therefore, we hypothesized oscillatory flow induced ISR via TLR2-TAK1-IKK1-3 pathway. To verify the hypothesis, we proposed to use gene expression vector, parallel plate chamber, RT-qPCR , immunoblotting, electron microscope, atomic force microscope as well as intravascular imaging techniques, in cultured endothelial cells, animals and patients with coronary artery diseases. Our results will provide the theoretical and experimental evidences and novel targets for the treatment of ISR.

血管震荡流引起内皮剪切力（ESS）梯度增大致斑块破裂或糜烂及血栓形成是急性冠状动脉综合征的主要病因。Toll样受体2 （TLR2）信号通路参与糜烂和易损斑块的发展，但其与支架内再狭窄（ISR）的关系不明。TAK1是TLR2通路的关键分子。研究表明药物洗脱支架术后分支开口ISR率极高，但机制不清楚。我们前期研究发现分支开口显著增大的ESS梯度与ISR密切相关。我们的预实验发现震荡流活化TLR2下游的核因子（NF）-kB激酶1-3抑制剂（IKK1-3）。据此，我们提出科学假设：震荡流通过激活TLR2-TAK1-IKK1-3导致ISR。为验证这一假设，我们拟采用内皮细胞、动物及冠心病患者，运用平行板流动腔、原子力显微镜、血管腔内成像等技术，从细胞和整体水平研究ESS梯度增大和震荡流促进ISR的作用及机制，从而为寻找防治ISR的新靶点提供理论及实验依据。

背景：内皮剪切力（ESS）是指血管内流动的血液和血管内皮之间的摩擦力，位于内皮细胞膜表面的多种膜蛋白（受体酪氨酸激酶、G 蛋白偶联受体、缝隙连接蛋白、整合素、细胞骨架网络和糖萼）和离子通道能够感知 ESS 变化的力学信号，并将 ESS 的力学信号转导入细胞内，激活多条信号通路而调节着细胞的功能、维持血管舒张功能。我们前期研究发现震荡流作用内皮细胞后 TOLL 样受体 4（TLR4）表达显著增加，这与他人的研究结果一致。研究发现 TLR 在慢性稳定斑块的发生发展中起着主要作用。TLR2 基因在内皮细胞，糜烂和破裂的斑块中高表达，且与 ESS 梯度增大显著相关，TLR4虽然在富含脂质的斑块中表达也较高；而 TLR2 敲除动物的粥样硬化斑块内炎性反应较轻、斑块表面罕见不规整。震荡流剪切应力(OSS)破坏内皮细胞内稳态，促进内皮炎症，氧化应激，从而导致动脉粥样硬化。在动脉粥样硬化病变中，toll样受体2(TLR2)和toll样受体4 (TLR4)高表达。然而，TLR2和TLR4调节OSS氧化变化、炎症反应和细胞信号转导的分子机制尚不清楚。.方法与结果: 在大鼠的左颈动脉进行颈动脉缩窄术(CAC)构建动物震荡流模型，右颈动脉为对照组，结扎一周后，切片取材；在细胞上用平行板流动室构建细胞震荡流模型，分别应用高剪切力20 dyn/cm2，震荡流±4 dyn/cm2。结果表明，OSS显著增加了小鼠的氧化负荷，这在一定程度上与TLR4的激活有关。OSS激活NOX2，对内皮细胞中的NOX1或NOX4无显著影响。OSS磷酸化了caveolin-1，促进其与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)结合，导致eNOS失活；OSS增加HUVECs细胞凋亡、炎症改变，通过下调TLR2的表达来逆转这些作用。OSS通过TLR2/TAK1/IKK2促进内皮炎症，加速动脉粥样硬化进展；另一方面OSS通过TLR4增加NOX2活性，降低eNOS的活性诱导氧化应激，加速动脉粥样硬化进展。.结论: 震荡流介导的HUVECs损伤可能与TLR2和TLR4的表达增加有关。因此，降低TLR2/4表达或抑制TLR2/TLR4激活可能是降低动脉粥样硬化发生率的有效途径。