活细胞原位代谢物-蛋白质相互作用研究新方法

Many cellular processes were adjusted by the interactions between metabolites and proteins, which play very important roles in biological body. AMACR protein is newly found as a biomarker for prostate cancer. The interaction between endogenous metabolites and AMACR protein will be helpful to find potential therapeutic targets of prostate cancer. In this subject, magnetic nanoparticles will be prepared with large capacity and low cytotoxicity and the metabolite-protein complex can be extracted and enriched in situ from living cells using the magnetic nanoparticles. The in vivo metabolite- protein interaction system will be constructed on this basis. The interactional metabolites with AMACR protein can be found and identified by the metabonomics method based on chromatography-mass spectrometry. Furthermore, the metabolite-protein complex can be characterized by structural mass spectrometry. Their stoichiometric ratio, dissociation constants, binding site and configuration change can be determined in detail. These metabolite-protein interactions will be helpful to find the new regulatory network of AMACR protein and new drug target.

代谢物-蛋白相互作用参与调控许多细胞过程，在生物体中发挥重要作用。它是了解代谢物对蛋白质功能调控机制的钥匙。AMACR蛋白是最近发现的针对前列腺癌的肿瘤标志物，研究内源性代谢物与AMACR蛋白的相互作用将可以提供潜在的前列腺癌治疗靶点。本课题拟通过研制高富集容量和低细胞毒性的磁性纳米新材料，构建活细胞中原位代谢物-蛋白相互作用体系。利用基于色谱-质谱联用技术的代谢组学方法，发现和鉴定与AMACR蛋白发生相互作用的靶标代谢物。建立基于结构质谱技术的表征代谢物-蛋白复合物方法，测定靶标代谢物-AMACR蛋白复合物的化学计量比和解离常数，确定靶标代谢物与AMACR蛋白的结合位点和构型改变情况。这些新发现的代谢物-AMACR蛋白相互作用将有助于发现新的AMACR蛋白调控网络和新的药物靶点。

代谢物-蛋白相互作用在生物体中发挥重要作用，参与调控许多细胞过程，如信号传导、酶反应、蛋白别构调节等。然而，由于缺乏有效的研究手段代谢物-蛋白质相互作用迄今为止没有被系统的研究。在蛋白固定化方面，金属离子亲和色谱结合磁性分离为组氨酸标签的融合蛋白固定化提供了一种方便有效的策略。通过层层自组装方法合成了负载容量大、生物相容性好的蛋白固定化磁性纳米材料（CMPEIn-Ni2+@SiO2@Fe3O4），实现组氨酸标签蛋白（如His-AMACR蛋白等）固定化和纯化。在代谢物-蛋白互作分析方法方面，利用超高分辨的傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS），发展了基于结构质谱技术的黄酮类代谢物-HSA蛋白质复合物的高灵敏表征方法；为了实现规模化筛选内源性配体，发展了基于代谢组学结合结构质谱技术的代谢物-蛋白相互作用研究方法并用于代谢组与PPARγ蛋白或AMACR蛋白互作研究；为了原位研究和分析活细胞中蛋白质-代谢物相互作用，发展了基于原位亲和蛋白纯化和质谱分析的活性代谢组学分析方法（ABMP）可以识别活细胞中致癌因子——甲粘蛋白（MTDH）与内源性代谢物相互作用。在互作体系研究方面，研究了内源性脂质代谢物与过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ蛋白）的互作体系，新发现3种溶血磷脂胆碱（LPC16:0、LPC18:0、LPC18:1）作为PPARγ蛋白潜在配体；利用分子模拟方法进行脂质代谢物LPC16:0与PPARγ蛋白互作的结合位点研究。研究了胆固醇与MTDH蛋白互作体系，揭示了MTDH作为一种致癌因素，可能通过与胆固醇相互作用从而调节癌症进展。已发表SCI收录论文13篇，申请发明专利5项，协助培养博士生2人。