基于新一代测序的脊肌萎缩症无创产前检测方法研究

Spinal muscular atrophy is one of the most common mortality-causing autosomal recessive diseases in the world. 81%~95% of SMA patients are caused by the homozygous deletion of exon 7 of the survival motor neuron 1 (SMN1) gene. For now, there is no effective therapy, and prenatal diagnosis is the most effective prevention. In this study, we plan to collect prenatal samples by families in which the probands have SMN1 exon 7 homozygous deletions, take maternal cell-free DNA as materials, test SNPs with high heterozygosity with self-developed multiple cSMART technology, invent methods to precisely, quickly and cost-effectively quantify the fetal DNA concentration. We will perform target capture and next-generation sequencing in the SMN and control gene regions, align the reads by the different base between SMN1 and SMN2, combine the cffDNA concentration and maternal genotype, develop data-analysis protocols to achieve the accurate copy numbers of SMN1 and SMN2, and establish the NGS-based SMA non-invasive prenatal testing method without the defects of traditional invasive prenatal diagnosis and the tests using circulation fetal cells.

脊肌萎缩症是全球最常见的致死性常染色体隐性遗传性疾病之一，81%~95%的患者是由位于5q13的生存运动神经元基因SMN1的7号外显子纯合缺失导致，与其序列高度相似的SMN2是影响病情严重程度的修饰基因。脊肌萎缩症目前无有效的治疗方法，产前诊断是预防患儿出生最有效的措施。本研究针对先证者为SMN1基因7号外显子纯合缺失型脊肌萎缩症的产前诊断家系，以孕妇血浆游离DNA作为材料，选择高度杂合SNP位点进行多重cSMART检测，研究精确、快捷、低廉的胎源DNA含量定量方法；对基因和对照保守区域实行目标捕获和高通量测序，利用SMN1、SMN2差异性碱基进行序列比对，结合胎源DNA含量和母亲基因型，开发数据分析流程，实现对胎儿SMN1、SMN2基因拷贝数的准确计数，克服传统侵入性产前诊断和循环细胞法产前检测的缺陷，建立基于新一代测序的脊肌萎缩症无创产前检测方法。

随着染色体病无创产前检测的发展和应用，单基因病的无创产前检测逐渐成为产前诊断领域的热点。脊肌萎缩症（SMA）是一类致死性的遗传性神经肌肉系统疾病，81%~95%的患者是由位于5q13的生存运动神经元基因SMN1的7号外显子纯合缺失导致。脊肌萎缩症目前治疗方式有限，研发和应用高精度产前检测和孕前群体筛查技术是预防患儿出生的基础。. 为探索数字PCR应用无创产前检测SMA的方法学，本研究完成了8个SMA gDNA样本以及18个SMA产前诊断家系cfDNA样本的数字PCR检测。结果显示8个gDNA样本SMN1、SMN2基因的拷贝数定量与MLPA检测结果完全符合；18个cfDNA样本28次cfDNA-dPCR实验除1个样本因微滴破裂导致实验失败外，其他样本均实现拷贝数判定，表明数字PCR在无创产前DNA样本中SMN1基因拷贝数定量的准确性和精确性。该技术准确性好，成本较低，有望逐步应用于SMA高危人群的无创产前筛查。. 本研究还通过锁核酸修饰引物碱基，引入双重探针，针对SMN1 7号外显子，建立了基于qPCR的双重扩增检测技术。并以收集的157个SMA患者、携带者以及正常人的gDNA样本验证了新技术的灵敏度和特异性均达100%。该技术极大改善了qPCR检测SMN1的特异性，同时提升了检测通量和操作性，不仅可应用于孕前、产前携带者筛查以指导家庭生育，同时可以应用于新生儿患者和携带者筛查。且该技术操作简单、经济，适宜基层推广。. 此外，本研究在前期基础上进一步优化环化单分子扩增和重测序技术(cSMART)方法，实现了无创产前检测靶向基因区域的高密度探针全覆盖，极大地扩展了cSMART的应用前景。通过收集33例PKU家系，开展无创产前临床前瞻性研究，结果表明无创产前检测与有创检测结果相比，方法总体检测的灵敏度为100.00%，特异性为96.15%。