miR-137 调控AMPK/自噬通路在非小细胞肺癌顺铂耐药中的作用及机制研究

Cisplatin resistance is a major factor affecting lung cancer chemotherapy results. Our preliminary study found that miR-137 may affect the sensitivity to cisplatin by regulating autophagy activity in lung cancer cells. AMPK α1 was verified as a target gene by bioinformatics analysis and luciferase reporter gene system test. Therefore, we suggested that miR-137 could modulate the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin by regulating AMPK α1/autophagy pathway. In our study, we aim to investigate the exact biological functions of miR-137 and analyze the relationship between miR-137 expression variances and cisplatin resistance in patients with lung cancer by retrospective clinical study. We aim to establish the potential role of miR-137 in AMPK/autophage signaling pathway and characterize the mechanisms of miR-137 in regulating the chemo-sensitivity in A549 lung cancer cells by gene overexpression and miRNA sponge techniques. There is no report about the regulation of miR-137 on autophagy activity and chemo-resistance in lung cancer cells published before. Hence miR-137 is a novel target for chemotherapy and may be beneficial for further clinical study. We would clarify the biological functions of miR-137 and establish the regulatory role of miR-137 on modulating the autophagy activity and chemo-sensitivity in lung cancer cells, providing some potential targets in prevention and treatments for non-small cell lung cancer patients.

顺铂耐药是影响肺癌化疗效果的重要因素。本项目组前期应用microarray等技术发现miR-137可能调节自噬活性而影响肺癌细胞对顺铂的敏感性，生物信息学分析及荧光素酶报告基因系统检测证实AMPK α1是其靶基因。因此我们推测miR-137通过调控AMPK α1、调节自噬活性而影响肺癌细胞对顺铂的敏感性。本研究拟：阐明miR-137在肺癌细胞的生物学特征；临床回顾性研究阐明miR-137与肺癌患者顺铂耐药之间的联系；以AMPK/自噬信号通路为切入点，采用基因过表达技术及miRNA海绵技术，论证miR-137影响肺癌A549细胞顺铂耐药性的作用及分子机制。由于miR-137调节自噬、影响肺癌细胞顺铂耐药性的研究均未见报道，因此本研究具有源头创新性，将有助于阐明miR-137的生物学特征，miR-137影响自噬及顺铂敏感性的作用及分子机制，并可能为非小细胞肺癌的防治提供新线索和潜在的干预靶标。

顺铂耐药及肺癌细胞转移是影响肺癌治疗效果的重要因素，但目前miR-137在调控顺铂耐药及转移分子机制尚不完全明了。我们通过定量RT –PCR发现肺癌细胞（A549、H1299）中的miR-137的表达显著低于BEAS-2B细胞,用5 umol/L的5-aza-dC处理A549和H1299细胞72小时，然后分析miR-137的表达改变。结果显示miR-137的表达在两种细胞中明显增加，这表明DNA甲基化与miR-137在肺癌中表达沉默有关。分析了在10对新鲜石蜡肺癌组织标本及其相邻的正常肺组织中的miRNA - 137表达水平，发现肺癌组织中miR-137的表达水平显著低于癌旁正常肺组。并且在56例术后标本中发现miRNA-137的表达水平与miRNA-137的甲基化率呈现显著的负相关。回顾性研究发现MiR-137的表达水平与患者性别、年龄、病理类型、肿瘤原发灶状况（T-status）、分化程度等均无明显关系(P>0.05)，差异无统计学意义。但MiR-137的表达水平与患者的吸烟史(P<0.05)、区域淋巴结转移状况（N-status）(P<0.01)、TNM分期(P<0.05)明显相关，差异有统计学意义，miR-137 低表达患者的无病生存期和总生存期均显著差于miRNA-137高表达。体外细胞实验发现A549/DDP细胞中miR-137表达降低，AMPK α1表达增高，采用3’UTR荧光素酶报告实验进行验证，发现miR-137能够结合于AMPK α1的3’UTR，并且MiR-137 通过抑制AMPK α1的表达进一步调控肺癌细胞出现顺铂耐药的变化。生物信息学显示miR-137的靶基因COX 2 (PTGS 2)有两个靶点，双荧光素酶报告基因实验确证了miR-137可以靶向结合COX 2 3'UTR的保守位点，抑制其表达。miR-137 通过抑制Cox 2的表达进一步调控细胞出现EMT的特征性改变，包括上皮标志E-cadherin的表达上升，间质标志Vimentin的表达下降。本研究有助于进一步阐明miR-137的生物学特征，miR-137顺铂敏感性及肺癌细胞转移侵袭的作用及分子机制，并可能为非小细胞肺癌的防治提供新线索和潜在的干预靶标。