多功能双阴性调节性T细胞促进移植免疫耐受

We first identified a novel type of Treg cells with TCR+CD3+CD4-CD8-NK1.1- phenotype, termed double-negative Treg cells (DN Tregs). These cells effectively suppress anti-donor T and NK cell responses. The immune regulatory function of CD4+Foxp3+, CD8+, DN, NKT, and TCR cells has been well described. The perplexing role of the different subsets of Tregs in similar experimental models has not yet been classified. There are three aims in this study: (1). To prevent Tm cell-mediated chronic heart graft rejection by DN Tregs. We will induce Tm cell by organ transplantation. DN Treg will be purified and activated in vitro. We will then study the mechanism of DN Treg-mediated CD4+ Tm impediment and test if adoptive transfer of DN Tregs can inhibit Tm generation and prevent chronic rejection in heart transplants. (2). To study the mechanism of DN Treg-mediated IDOhighDCs induction and examine whether the DN Treg-induced IDOhighDCs could attenuate T cell-mediated graft rejection. DN Treg will be purified from OVA-specific TCR transgenic B6-OT1 mice. DCs will be developed from bone marrow of OVA transgenic mice. DCs and DN Tregs will be co-cultured. Neutralizing antibodies against CTLA-4, OPN, IFNand TGF(all are IDO inducing factors) will be added in the co-culture either together or individually to block IDOhighDCs production. We will study whether the DN Treg-induced IDOhighDCs could attenuate T cell-mediated graft rejection and induce long term graft survival. (3). To determine the mechanism of DN Treg-mediated conversion of CD4+Foxp3+ Tregs. We aim to identify the molecules that are involved in the DN Treg-mediated CD4+Foxp3+ Treg conversion and explore whether DN and CD4+Foxp3+ Treg cells act synergistically to prevent chronic heart transplant rejection. We will analyze the roles of OPN, IFNand TGF in DN Treg-induced CD4+Foxp3+ Tregs using GFP-knockin-Foxp3 mice that co-express green fluorescence protein (GFP) and Foxp3 as the expression of Foxp3 will make cells GFP+. Furthermore, DN Tregs and CD4+CD25+ Tregs, either alone or together, will be transferred into recipients before BALB/c-to-C57BL/6 heart transplantation. We will determine whether DN and CD4+Foxp3+ Treg cells act synergistically to prevent chronic heart transplant rejection.

我们发现了一种新型的调节性T细胞亚型：TCR+CD3+CD4-CD8-NK1.1-，称为双阴性调节性T细胞（DN Treg），此类细胞具有强力的抑制抗供体T与NK细胞的应答能力，能使器官移植长期生存。但是不同亚型的Treg在调控移植免疫反应的共存性机制和功能有待进一步阐明。本项目将从以下三个方面进行研究：1）研究DN Treg对记忆性T细胞介导的移植心脏的慢性排斥反应所产生的抑制作用及其机制。2）DN Treg诱导IDO高表达DC的免疫抑制功能及其防止移植器官的排斥反应。建立一种共培养体系（DN Treg和DC），抗体阻断DN Treg释放与IDO产生有关的细胞因子，再用DN Treg诱导IDO高表达的DC来治疗同种异体移植小鼠，以进一步明确其抗免疫排斥的作用。3）DN Treg诱导CD4 +Treg转化的分子机制，明确两种调节性细胞相互促进转化的分子机制及其在器官移植中抗排斥反应的意义。

背景：在不可逆的器官损伤后，移植是最有效的治疗选择。然而，大约50％的移植器官在10年内失败;不幸的是，这个比率在过去30年里没有改善。许多研究已显示调节性T细胞（Tregs）在长期移植存活中起重要作用。我们以前首先鉴定了具有TCR + CD3 + CD4-CD8-表型（DN Tregs）的新型Treg细胞。我们想研究T细胞介导的心脏移植物排斥的机制以及DN Tregs如何调节排斥反应。.主要方法：我们从供体小鼠中纯化心脏细胞。 T和DN Treg从移植受体中纯化。然后，我们研究了T细胞介导的供体心脏细胞死亡和DN Treg介导的CD4 Tm的抑制机制，并测试了DN Tregs的过继转输是否可以预防小鼠的慢性心脏移植物排斥。.贡献：在本研究期间，我们在科学期刊和国际会议上发表了10篇出版物。更重要的是，我们培训了3名博士生和5名硕士生和本科生。.研究数据：.1.坏死性凋亡参与CD4 T细胞介导的微血管内皮细胞死亡和慢性心脏移植排斥反应。我们已经发现CD4 T细胞介导的心脏移植物排斥，使用RIPK3缺陷的供体移植物可以抑制排斥。因此，RIPK3介导的坏死性凋亡是充分改善长期移植物存活的重要治疗靶标。.2.细胞内pH调节细胞凋亡和坏死性凋亡：在器官缺血或炎症期间，细胞内pH降低。在我们的研究中，证实了在中性pH下，caspase-8抑制剂并不减弱细胞死亡， 反而增强RIPK1依赖性的坏死性死亡。相反，caspase -8抑制和RIPK1抑制均在pH=6下减弱细胞死亡。这些结果表明需要考虑在不同pH环境下，使用细胞死亡抑制剂会导至不同后果。.3. Spi6保护同种异体活性CD4 Tm免于DN Tregs攻击：在移植中，DN Tregs的转输抑制由CD4 / CD8 Teff和CD8 Tm细胞介导的排斥反应（> 60天）但不抑制CD4 Tm细胞介导的排斥反应（25天）。 CD4 Tm细胞高度表达granzyme B 抑制分子Spi6。 Spi6缺陷使CD4 Tm易受DN Treg抑制，因此Spi6是移植耐受的重要靶标。.4. TLR和激酶信号通路的同时基因沉默预防心脏移植中的同种异体移植物排斥：用mTOR，MyD88和TRIF siRNA处理进一步延长同种异体心脏移植物存活，同时上调T细胞衰竭和Tregs。该研究强调了siRNA在临床移植中的治疗潜力。..