高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒力增强的分子基础研究

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是目前严重危害各国养猪业的重要传染病，而我国特有的高致病性PRRS病毒的出现及其所导致的致病能力增强等变化尤为引人关注，本项目借助高致病性PRRS病毒 HuN4株强/弱毒感染性克隆平台，通过强/弱毒功能性基因的替换、重组等技术，构建一系列PRRS病毒强/弱毒嵌合突变体感染性克隆毒株，并利用拯救的嵌合突变体感染性克隆毒株进行动物致病性试验，通过感染动物的临床表现、病毒在体内的分布、病毒载量变化、靶器官的病理变化、主要炎性分子表达水平的变化等指标评价强/弱毒基因替换的嵌合突变体克隆毒株对猪致病性的影响，确定高致病性PRRS病毒基因组中与病毒毒力变化相关的目标基因，分析目标基因的生物学特性，阐明高致病性PRRS病毒毒力增强的分子基础，为研究PRRS病毒的致病机理和有效疫苗的研制提供依据。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）是近年来在我国流行的优势毒株，为了探讨影响高致病性PRRSV毒力强弱变化主要因素，本研究以高致病性PRRSV分离株HuN4株和弱毒HuN4- F112 疫苗株为研究对象，在PRRSV HuN4/HuN4-F112株强/弱毒感染性克隆平台的基础上。分别将强毒与弱毒株的非结构蛋白基因区ORF1a、ORF1b以及结构蛋白基因区域ORF2-7相互置换，构建并获得了6个强/弱毒嵌合感染性克隆毒株。对6株嵌合病毒生物学特性分析结果显示，6株嵌合病毒的增殖能力均略高于亲本强毒株，而低于亲本弱毒疫苗株，其中以强毒为骨架的嵌合弱毒ORF1a的嵌合毒株其增殖能力显著高于亲本强毒HuN4，而以弱毒为骨架的嵌合强毒ORF1a的嵌合毒株在的增殖能力明显低于其亲本弱毒HuN4-F112，表明ORF1a可能对PRRSV在Marc-145细胞的增殖中发挥重要作用。同时我们将获得的6株嵌合病毒及其亲本强毒分别接种30日龄健康仔猪,,致病性分析结果显示，亲本强毒组试验猪均发病，且有40%死亡，而6株嵌合病毒攻毒组均未致死试验猪，但试验猪血清中病毒载量存在明显差异，亲本强毒组显著高于其他各组，而以强毒为骨架替换弱毒株结构蛋白区的嵌合病毒与亲本毒之间差异最小。对血清中部分细胞因子进行检测，结果显示细胞因子IL-6在各实验组中差异明显。IL-10在亲本强毒组与rHuN4-F5-ORF2-7组均有升高，分析表明这些变化与非结构蛋白ORF1a和ORF1b具有一定的相关性。为了进一步分析与PRRSV毒力相关基因，我们分别构建了NSP2单基因替换的两株嵌合病毒，将两株嵌合病毒分别感染PAM细胞，并在体外分析了嵌合病毒感染PAM感染的效率，结果显示以强毒HuN-F4为骨架替换弱毒的NSP2基因的嵌合病毒对PAM感染比例显著降低，而以弱毒HuN-F112为骨架替换强毒株的NSP2基因的嵌合病毒感染PAM效率，表明NSP2基因与PRRSV在PAM细胞中的复制能力密切相关，推测NSP2基因可能是影响PRRSV毒力增强的主要基因之一，本研究结果为揭示高致病性猪繁殖与呼吸综征病毒致病性增强的机理提供了新的研究数据。