高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）引起高热的分子机制研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) caused by PRRSV is one of the most economically important viral diseases for the swine industry worldwide. PRRSV, in particular, HP-PRRSV, can cause high fever. In our previous study, we found out that HP-PRRSV infection could increase PGE2 production by up-regulation of COX-1. Our results indicate that HP-PPRSV elicits the expression of COX-1 through the ERK1/2-p-C/EBP-signaling pathway, resulting in the increase of PGE2, which plays a critical role in inducing high fever in PRRSV infected pigs. In this study, we are going to further exploit the mechanisms by which HP-PRRSV leads to high fever. We will study which HP-PRRSV protein(s) promotes the PGE2 secretion, and the related molecular mechanism. Moreover, we will study the different abilities of HP-PRRSV and typical PRRSV strains to induce fever. In addition, we will study the correlation between the PGE2 levels and the severity of symptoms caused by PRRSV infection. Finally, we will try to attenuate HP-PRRSV based our results using reverse genetics technique. This work will provide new insights into the molecular mechanisms of HP-PRRSV pathogenesis and new clues for new vaccine strategies against PRRSV.

高致病性猪繁殖与呼吸综合征（无名高热）由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）引起，其特点为急性高热、高感染率和高致死率。我们前期研究发现HP-PRRSV可激活ERK信号通路，促进COX-1的转录表达，进而诱导调前列腺素E2 （PGE2）产生。HP-PRRSV上调PGE2可能是引起猪高热的原因之一。在本项目中，我们将进一步研究HP-PRRSV上调PGE2所依赖的信号通路及相关分子机理；确定诱导PGE2上调的HP-PRRSV蛋白及其作用的分子机制；分析高致病性PRRSV与经典PRSSV毒株诱导发热能力不同的分子机理；并根据研究结果对HP-PRRSV进行致弱。本课题成果将进一步揭示HP-PRRSV的致病机理，为开发新型抗PRRSV疫苗提供理论依据。

首先，我们利用体外培养小胶质细胞模型对HP-PRRSV诱导高热的机制进行了研究。研究发现，HP-PRRSV感染小胶质细胞，能够显著诱导环氧化酶-2（COX-2）的表达。机制研究表明，HP-PRRSV通过激活MEK1-ERK1/2-C/EBPβ信号通路诱导COX-2的产生，进而促进前列腺素2（PGE2）的大量合成。通过对HP-PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白进行筛选，发现HP-PRRSV的非结构蛋白2（nsp2）可以通过激活MEK1-ERK1/2-C/EBPβ信号通路上调COX-2的表达，而nsp2的500-596 aa和658-777 aa区域在nsp2上调COX-2的表达以及诱导PGE2的产生中发挥着关键作用。应用反向遗传技术，将nsp2的500-596 aa和658-777 aa区域进行单缺失和双缺失，构建了缺失HP-PRRSV重组毒株。通过体内外实验研究发现，重组病毒诱导COX-2的表达以及PGE2产生的能力与HP-PRRSV野毒株相比显著的下降。更为重要的是，重组HP-PRRSV毒株诱发高热的能力和致病性显著降低，不出现高致病性猪繁殖与呼吸综合征临床症状。研究成果为进一步明晰HP-PRRSV诱导高热的机制和研制HP-PRRSV弱毒疫苗提供理论基础。. 同时，我们对HP-PRRSV是否通过调控IL-17产生影响产热进行了研究。我们发现HP-PRRSV明显诱导IL-17上调。进一步研究发现HP-PRRSV 的非结构蛋白nsp11可以通过激活IRAK1-PI3K-P38MAPK-C/EBPβ/CREB信号通路诱导IL-17的表达。缺失或定点突变表明，Ser74 和 Phe76氨基酸在nsp11诱导IL-17中起到了关键作用。将Ser74和 Phe76突变，不仅显著降低了nsp11诱导IL-17的能力，而且抑制了PRRSV的复制。然而，我们发现PI3K抑制剂虽然能够抑制体内IL-17的产生及减轻肺部炎症，但却不能明显抑制发热。. 此外，我们对HP-PRRSV诱导IL-15、IL-8、IL-12及I型IFN产生和机制进行了研究。研究结果表明，HP-PRRSV能够诱导IL-8和IL-12的产生。应用PAM感染模型证明，将185位天冬氨酸突变构建的重组HP-PRRSV不仅能够有效诱导较高水平的I型IFN，而且具有较弱的致病性。然而，是否影响发热有待进一步研究。