组蛋白去乙酰化酶介导下的miRNA在JAK2V617F突变阴性的骨髓增殖性疾病中的功能研究

The constitutive activation of the Janus kinase 2/singal transducer and activator of transcription(JAK2/STAT) signaling pathway, which is activated by JAK2V617F mutation, is the key factor leading to myeloproliferative diseases (MPDs).However the mechanism of MPDs without JAK2V617F mutation is still unknown. Explaining the factors which result in the constitutive activation of JAK2/STAT signaling pathway is the hot and difficult points in the mechanism of MPDs without JAK2V617F mutation. Our previous study showed that miR-101/miR-375 were significantly downregulated in patients without JAK2V617F mutation than those with JAK2V617F mutation. Moreover the downregulation of miR-101/miR-375 is possibly regulated by overexpression of histone deacetylases (HDACs) in MPDs. We are planning to take software predication, MTT test, clonogenic activity, and nude mice xenograft tumor formation to test the inhibition of JAK2/STAT signaling pathway through the overexpression of miR-101/miR-375. Moreover the specific inhibitors of HDACs will be taken to prove whether miR-101/miR-375 are modulated by HDACs. Our study contributes to explore the functional role of miR-101/miR-375 in MPDs. Furthermore these study will also provide the new strategy for the diagnosis and treatment of MPDs without JAK2V617F mutation. Finally we also discuss the possibility that miR-101/miR-375 act as new molecular target genes for the treatment of MPDs.

JAK2V617F突变导致JAK2/STAT信号通路的异常活化是骨髓增殖性疾病（MPDs）发病机制中的关键因素，然而JAK2V617F突变阴性的MPDs发病机制尚未明确。课题组前期实验发现两种miRNAs：miR-101/miR-375 在JAK2V617F 突变阴性MPDs 患者中表达明显低于突变阳性患者，而miR-101/miR-375本身低表达又可能受组蛋白去乙酰化酶(HDACs)调控。我们拟进一步通过体外靶基因实验、集落形成实验、裸鼠移植肿瘤等实验观察过表达的miR-101/miR-375 对JAK2/STAT通路抑制作用；用HDACs特异性抑制剂验证miR-101/miR-375是否受HDACs调控。本研究分别从细胞、动物模型、临床标本三个方面来阐述miR-101/miR-375在MPDs中的作用机制，为JAK2V617F突变阴性的MPDs诊断和治疗提供新思路和新策略。

STAT信号通路的异常活化是骨髓增殖性肿瘤(MPN)发病机制中的共同关键因素。阐明何种因素导致JAK2/STAT通路的异常活化，是目前JAK2V617F突变阴性的MPN发病机制研究中的热点和难点，具有重要的临床诊断及治疗意义。我们以MPN发病机制中起关键作用的JAK2/STAT信号通路为靶点，发现表观遗传学介导的miR-375沉默促进了JAK2V617F突变阴性的JAK2/STAT信号通路的持续活化，恢复miR-375的表达在K562及HEL细胞株中明显抑制JAK2/STAT信号通路。虽然miR-101也能抑制JAK2蛋白表达，但是对STAT3/5蛋白的抑制作用不明显。课题组以MPN中持续活化的JAK2/STAT信号通路为靶标，体外筛选能明显抑制JAK2/STAT信号通路的小分子化合物。通过系列实验我们成功地发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠在K562及HEL细胞株中能够明显地抑制JAK2/STAT信号通路。机制研究表明：丁酸钠通过增强SOCS1/3启动子区域组蛋白H3及H4乙酰化表达水平，进而上调SOCS1/3蛋白表达水平，而上调的SOCS1/3蛋白能够抑制JAK2/STAT信号通路。因此，丁酸钠主要通过上调JAK2/STAT信号通路负反馈调节蛋白SOCS1/3表达水平抑制JAK2/STAT信号通路。我们进一步发现天然小分子化合物姜黄素在体外具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性，而且可以下调Ⅰ类HDAC蛋白表达水平，其中包括HDAC1、HDAC3及HDAC8蛋白。机制研究表明：姜黄素通过抑制HDAC蛋白，上调SOCS1/3蛋白表达水平，最终在MPN中抑制活化的JAK2/STAT信号通路。同时我们进一步发现敲除HDAC8，而不是HDAC1和HDAC3，升高SOCS1/3蛋白水平。我们的研究首次从miRNA调控层面来阐述JAK2V617F突变阴性的MPN 发病机制，拓宽人们对MPNs发病机制的理解，为MPN诊断和治疗提供新思路和新策略。同时我们发现了两类小分子化合物HDAC抑制剂丁酸钠以及天然小分子化合物姜黄素在体外通过上调SOCS1/3蛋白表达水平抑制JAK2/STAT信号通路。这些实验结果为HDAC抑制剂及姜黄素进一步应用于MPN的临床治疗提供了良好的前期数据。