具有抗氧化功能的壳聚糖衍生物细胞支架的研究

Ischemic heart disease is a serious threat to human safety and health, often accompanied by massive death of cardiomyocytes. Although current treatments can relieve symptoms, it still can not completely cured, there is an urgent need for new ways to repair damaged heart tissue to rebuild the heart function. Myocardial tissue transplantation for the treatment of ischemic heart disease has brought new hope, but there is a long-standing problem of low survival rate of the cells. This application is intended to carry out basic research to solve this problem, design series of chitosan - citric acid - ascorbic acid condensates, for the preparation of antioxidative injectable biodegradable hydrogel scaffold, expect to get a good survival rate of cardiac cell transplantation . Chitosan, citric acid and ascorbic acid can be synergistic antioxidant response of the original tissue damage and oxidative stress caused by foreign objects. Chitosan has an excellent biocompatibility, citric acid is a natural body's substances, and ascorbic acid is a necessary body nutrients, three combined togeter to ensure the biocompatibility. Transferring the transplanted cells into the damage tissue by injection can reduce the hazards of surgery pain. The non-flowable semi-solid state hydrogel after injection can support of the transfer cells. With the growth of transplanted cells, scaffold gradually degrades excreted and eventually rebuilds cardiac function.

缺血性心脏疾病严重威胁人类的生命安全与健康，常伴随心肌细胞的大量死亡，目前的治疗手段虽可缓解症状但却无法根治，因此迫切需要新的方法来修复受损心肌组织以重建心脏的功能。心肌细胞移植为缺血性心脏疾病的治疗带来了新的希望，但长久以来存在着细胞成活率低的问题。本申请拟针对这一问题进行应用基础研究，设计系列壳聚糖-柠檬酸-抗坏血酸缩合物，用以制备抗氧化可注射可降解水凝胶心肌细胞支架，期望获得理想的心肌细胞移植成活率。壳聚糖、柠檬酸和抗坏血酸可协同抗氧化，应对组织损伤处原有和外物引起的氧化应激；壳聚糖生物相容性极好，柠檬酸为机体固有物质，抗坏血酸为机体必须的营养素，三者结合确保了生物相容性；以注射方式传递所移植细胞入组织损伤部位，减少手术的危害与疼痛；注射后水凝胶在体温作用下呈不可流动的半固体状态，支撑所传递的细胞；随着所移植心肌细胞的良好生长，支架材料逐渐降解排出体外，最终重建心脏功能。

心肌梗死的发生与死亡率在逐年上升，可注射心肌组织工程因具有修复受损心肌的潜能，为心血管疾病的治疗带来希望，心肌梗死发生时常伴随明显的氧化应激反应，表现为自由基的堆积。自由基的过度产生可破坏移植细胞和自身细胞的膜脂质、蛋白质和DNA，从而严重的影响心肌梗死的治疗效果。本研究设计了具有抗氧化性功能的温敏性，用作细胞移植治疗的载体基质，期望能够改善心肌梗死处氧化应激微环境，提高所移植细胞的滞留率和成活率。. 本研究制备了壳聚糖/柠檬酸/抗坏血酸水凝胶（CS、CSCA、CSVC和CCA）和α-生育酚脂质体水凝胶(AT-LCH)，并对其进行了制剂学性质研究、体外抗氧化研究、生物相容性研究、体内外降解研究、对抗双氧水诱导的细胞氧化应激环境研究等。制备的水凝胶胶凝时间均约为30 min，胶凝温度约为34°C，pH值约为7.2。扫描电镜显示水凝胶为网格结构。皮下注射4周后，CSCA及CSVC组水凝胶降解约50%，7周后基本降解完全。将心肌原代细胞接种在CS、CSCA、CSVC和CCA四组水凝胶的表面及内部12 h，随着时间的推移，吸光度值不断增加，细胞黏附性增强，Live/Dead染色结果显示，心肌原代细胞在不同组水凝胶中培养1 d和3 d时，CSVC组出现的死细胞较少，H&E染色结果表明细胞核及细胞浆染色情况正常且形态清晰。将心肌原代细胞接种在四组水凝胶内部，在双氧水诱导的氧化应激条件下培养，CSVC组中的死细胞数量明显少于CS及CSCA组，与CSVC组相比，经DCFH-DA染色后，CS及CSCA组中绿色荧光（活性氧水平）的强度更强。制备的AT-LCH体外降解9 d后基本降解完全；体内降解6周后，AT-LCH重量减少至初始状态的50%。体外释放实验中显示AT-LCH对α-生育酚具有缓释作用。AT-LCH浸提液对L929细胞活力未产生抑制作用。AT-LCH生物相容性好，且对心肌细胞有良好的黏附性，可支撑心肌原代细胞在其内部存活。制备的水凝胶有望应用于心肌梗死细胞移植的治疗，提高抑制细胞的成活率。