结构修饰的siRNA合成和RNA干扰技术在药物靶标寻找中的研究

siRNA作为治疗剂呈现了很好的前景，主要问题表现为：(1)体内转运困难，合成的siRNA导入细胞后易被RNase降解, 难于准确地到达靶部位; (2)RNA干扰技术能够特异有效地指导基因沉默, 但在某些情况下存在"脱靶效应"(Off-Target Effect), 即非特异性抑制作用;(3)如何方便经济地设计和制备特定的siRNA文库，以便利用RNAi技术寻找药物靶和有治疗作用的siRNA。本项申请计划开展：a. 化学修饰的siRNA，包括带有氨基及其它基团的异核苷并用于掺入siRNA，及设计合成脂类、肽类等缀合的siRNA; b. 提高修饰的siRNA的RNAi效应、细胞膜通透性和酶稳定性；c. 通过siRNA对基因沉黙机制的研究找到"脱靶效应"的原因、规律, 提高与靶mRNA作用选择性，从而设计合成作用专一的siRNA；d.利用前期建立的siRNA文库和筛选方法用于药靶寻找。

本课题利用D-/L-异核苷(I)系统修饰了siRNA不同位点，构建了双-3’-肽-siRNA(II)缀合物。发现反义链大部分位点D-I修饰明显提高siRNA的血清稳定性；义链大部分位点I修饰能够降低其脱靶效应。发现义链8-D-I修饰靶向宿主MEK1激酶mRNA的siRNA抗病毒活性明显提高; 计算模拟发现Ago蛋白PAZ亚基loop区与该修饰物的open-close运动频率加大，Ago蛋白与8-D-I修饰的双链或单链之间的结合自由能提高，修饰的siRNA与Ago2蛋白的晶体结构解析支持了这一结论，从而义链易于切割离去，从而促进RISC形成而提高沉默活性。发现II的酶稳定性明显提高，沉默靶基因的时效性提高, 两亲性脂质体可更高效运载其跨膜转运；初步证实了义链5’-L-I修饰II作为先导结构的研究设想。.阐明了生物表达dsRNA活性弱于shRNA分子机制，并通过抑制siRNA双链间的拮抗作用，实现了稳定转导dsRNA对靶基因的沉默，扩大了dsRNA的应用范围。基于RNAi技术，构建了以病毒进入为靶的药物筛选体系，阐明了五环三萜类似物抑制HCV的分子机理；小鼠模型确证了AKR1C3通过干预ROS通路致恶性肿瘤放射耐受的新靶点，探讨了癌基因c-Met靶向治疗(沉默)联合放化疗对结直肠癌细胞增殖和转移的影响，与炎症恶化相关的miRNA、信号通络及相关网络潜在调控。