辛开苦降法治疗功能性消化不良的体外分子机制研究

In Chinese Medicine, functional dyspepsia (FD) is classified in the category of "Pi Man", a cold-heat complex syndrome, which is a very common stomach disorder in clinical practice. In our preliminary research, we discovered a decreased expression of some genes related to energy metabolism, such as GSTP2, SOD2, α-enolase and VDAC-1, in the gastric antrum of the FD rats after treated with WeiKangNing，an effective medicine for this disorder. However, how WeiKangNing works remains to be elucidated. It has been well established that oxidation damage and metabolic disorders contribute to abnormal gastrointestinal motility, a typical symptom in FD and WeiKangNing is able to improve the function of stomach. In this proposed study, we hypothesize that WeiKangNing displays therapeutic effects on FD through regulating the expression of energy metabolic genes.To test our hypothesis, a epithelial cell in vitro line of gestric antrum, will be used to determine the expression of GSTP2, SOD2, α-enolase and VDAC-1 in the presence or absence of WeiKangNing.Upon knocking down of these genes by using siRNA separately, energy metabolism, antioxidative capbility, proiferation, apoptosis and autophagy will be investigated in the cells treated with or without WeiKangNing. The information obtained from our study will provide new insight into the molecular mechanism by which WeiKangNing treats FD.

功能性消化不良(FD)属于中医 "痞满"范畴。寒热错杂型是临床常见证型。我们在前期研究中发现与能量代谢及氧化损伤保护有关的蛋白GSTP2、SOD2、α-enolase和VDAC -1在FD模型大鼠的胃窦组织中表达降低，表明氧化损伤和能量代谢异常是FD模型大鼠胃肠动力障碍的物质基础，辨证使用中药治疗可以调控上述蛋白表达从而改善胃肠功能状态。我们拟在前期研究基础上探索GSTP2、SOD2、VDAC-1、a-enolase等蛋白在体外培养的胃上皮细胞的表达及其在中医辛开苦降法代表方剂胃康宁作用下的表达调控；然后研究这些调控结果对细胞物质能量代谢及抗氧化能力、细胞增殖、凋亡、自噬等细胞生物学功能的影响；最后通过对相关转录因子的表达研究深入探讨辛开苦降法调控这些蛋白质表达的作用机制，并通过相应的siRNA沉默转录因子后进一步确证实验结果，为中医辛开苦降法治疗FD的机制研究提供新的依据。

目的：在前期蛋白组学的基础上，观察辛开苦降代表方胃康宁对能量代谢相关指标VDAC1 、Enolase以及细胞内部抗氧化物质SOD2 、GSTP1的影响，胃康宁通过转录因子Nrf2对GSTP1、SOD2、VDAC-1、Enolase等蛋白的调控机制，以及这种调控作用对细胞生物学功能的影响，为中医辛开苦降法治疗功能性消化不良提供理论依据。方法：体外培养人GES-1、MKN28、CRL1739三种胃上皮细胞，运用RT-PCR法和Western blot法检测胃康宁在基因和蛋白水平对VDAC1 、Enolase、SOD2 、GSTP1的影响；通过细胞功能学实验，探讨胃康宁对胃上皮细胞的生物学功能的影响，分别构建GSTP2、SOD2、VDAC-1、Enolase四种蛋白质的过表达载体和siRNA，转染胃上皮细胞后，研究四种蛋白在过表达和沉默时对上述细胞生物学功能的影响。Western blotting 检测评价Nrf2 核内和胞质蛋白水平，激光共聚焦法观察Nrf2核转位情况，RT-PCR 检测Nrf2及其下游基因NQO1、HO-1、GCLM 和GCLC mRNA 表达水平。分别建立Nrf2过表达和沉默细胞株，Western blotting 检测评价Nrf2过表达和沉默效果；通过RT-PCR和Western blot观察胃康宁在Nrf2基因过表达和抑制时GSTP1、SOD2等蛋白的表达变化，以及细胞生物学活性的影响。结果：研究发现胃康宁在基因和蛋白水平上均可促进SOD2 、GSTP1等蛋白的表达。胃康宁对细胞生物学功能具有一定影响，且受到SOD2 、GSTP1等蛋白不同程度的调控。胃康宁能显著诱导Nrf2 核转位, 其下游抗氧化酶基因NQO1、GCLC 、GCLM和HO-1 mRNA 表达水平也显著增加。Nrf2过表达可导致胃上皮细胞中SOD2、GSTP1表达增高；而Nrf2的表达被siRNA-Nrf2抑制后，胃康宁诱导SOD2和GSTP1表达水平升高的能力也随之减弱。胃康宁对细胞生物学活性的影响亦受到Nrf2的调控。结论：胃康宁能促进胃黏膜上皮细胞内部抗氧化物质SOD2 、GSTP1等的表达；能通过激活Nrf2/ARE 通路，调节SOD2 、GSTP1等蛋白的表达来调节和维持细胞能量代谢及抗氧化应激水平，保护胃肠组织生物膜免受损伤，可能是中药胃康宁治疗FD的作用机理之一。