食品级细菌双精氨酸信号肽的分泌机制研究

The bacterial twin-arginine translocation (Tat) pathway can efficiently export the folded proteins outside the bacterial cell wall, thus it has become a hotspot for international protein transport research. The food-grade Gram-positive Staphylococcus carnosus plays a key role and economic value in meat fermentation. Furthermore, it will be an excellent host under international development for genetic manipulation. However, the Tat translocation mechanism of its heterologous proteins remains unclear. On the basis of our previous results, we plan to investigate the roles of localization and translocation secretion of the GFP reporter from S. carnosus host by various Tat signal peptides, and to elucidate the Tat secretion mechanism by estabolishing an novel structure model for its Tat signal peptides and constructing the artificial Tat signal peptide element. By this way, our research will provide a solid foundation for the insight of constructing efficient food-grade Tat system for heterologous protein translocation, and further research on protein chaperones, heterologous protein surface display, artificial antibody scfreening, oral living vaccines, systems biology and synthetic biology as well as the applications in domestic biotechnology industries.

细菌双精氨酸Tat转运分泌途径能够高效率地跨膜转运处于折叠状态的蛋白质，已成为国际上蛋白质转运研究的一个热点。革兰氏阳性的食品级肉葡萄球菌在肉类发酵过程中具有十分重要的作用与经济价值，同时也是国际上正在开发的基因工程优良宿主菌，但其Tat途径分泌外源蛋白的机制尚不明确。在我们已有的研究基础上，拟采用绿色荧光蛋白(GFP)为报告蛋白，探讨不同来源的Tat信号肽介导GFP在肉葡萄球菌细胞中的定位、转运与分泌规律，建立相应的Tat信号肽结构模型，并通过构建高效分泌外源蛋白质的通用人工Tat信号肽元件，揭示肉葡萄球菌的Tat信号肽分泌机制，从而为构建食品级Tat高效分泌外源蛋白系统提供理论依据，并为分子伴侣研究、外源蛋白分泌和表面展示、人工抗体筛选、口服活体疫苗以及系统生物学与合成生物学等研究和我国生物技术产业应用奠定良好的理论与应用基础平台。

细菌双精氨酸转运Tat系统能够高效率地跨膜转运处于折叠状态的蛋白质，已成为国际上蛋白质转运研究的一个热点。食品级的肉葡萄球菌在肉类发酵过程中具有十分重要的作用与经济价值，同时也是国际上正在开发的基因工程优良宿主菌，但其分泌外源蛋白的机制尚不明确。.本项目首先通过生物信息学方法，建立了包括1040株原核细菌与古生菌中48106条潜在Tat信号肽信息库；开发了肉葡萄球菌的合成培养基，并优化肉葡萄球菌的电转化条件；通过对肉葡萄球菌EfeB蛋白Tat信号肽的理论切割位点之后延伸18个自身的氨基酸残基，并添加3-5个相同氨基酸残基组成的Linker，以及对报告蛋白EGFP分子的位点改造，明显提高了Tat信号肽跨膜转运EGFP的效率，但过度延伸Tat信号肽反而降低其分泌效率；目前已筛选了8个不同来源的有效跨膜转运活性GFP的Tat信号肽元件；还发现在EfeB的Tat信号肽的c区切割位点之前插入一个HA标签，可提高38.6%的EGFP分泌效率，进而可直接用作人工Tat信号肽元件。在此基础上，总结出了提高Tat信号肽分泌的规律，并构建出高效分泌EGFP的人工Tat信号肽元件以及相应的Tat信号肽分泌载体。此外，本项目还开展了Tat信号肽转运分泌外源的萤火虫荧光素酶（FLUC）、分泌型碱性磷酸酯酶（SEAP）以及EGFP-SEAP融合双报告蛋白的研究，进一步证明了Tat信号肽的普遍可替换性以及与宿主Tat转运酶之间的普遍适配性，并证实了本项目提出的“人工Tat信号肽元件”假说的合理性与可行性。