基于液相色谱/质谱联用技术的卵巢癌患者尿液中蝶呤类化合物的代谢谱研究

Pteridines are important biomarkers metabolites related to several biochemical pathways, the level of pteridinic compounds in biological fluids is considered as a promising tool in cancer diagnosis. However, the detection and quantification of these compounds has been fraught with analytical difficulties, such as occurrence under varied oxidation states, extremely fragile reduced forms; a complex group of biological compounds and low natural concentrations in the micro- and nano-molar range. An anti-oxidation sample pretreatment and a specific,sensitive and stability liquid chromatography-tandem mass spectrometry method to simultaneously determine three oxidation species of urinary pteridinic biomarkers will be established. This method will be applied for analyzing clinical samples from benign,borderline and malignant ovarian tumors and control subjects, and different renal dilution factors will be studied for proper investigation of urinary pteridines. Principal components analysis, partial least square discriminant analysis and artificial neural network will be conducted to analyze these data. Researches in this project will have important reference value for further investigation of the correlation between the level of pteridines and cancer patients. This new tumor markers will offer more sensitive and effective screening and early diagnosis for the ovarian carcinoma in future.

蝶呤类化合物是一类重要的代谢标志物，涉及到人体内的多个生化过程，其体液水平被认为是一个潜在的癌症诊断指标。然而，蝶呤化合物的检测是当前研究的难点，如该类化合物存在不同的氧化阶段，尤其是还原态极易氧化、体液中组分众多而含量甚微（微摩尔至纳摩尔水平）等。针对这些难点问题，研究尿液的抗氧化处理方法和高效液相色谱/质谱联用检测技术，建立特异性强、灵敏度高、稳定性好的不同氧化形态蝶呤化合物同时分析新方法；并应用所建立的方法对良性、交界性和恶性卵巢肿瘤患者以及对照组的尿液样本进行分析，探讨不同校正方法对抵消尿液分析结果个体差异和体内变异的影响；采用主成分分析法、偏最小二乘判别分析法和人工神经网络对卵巢癌患者尿液蝶呤化合物水平进行模式识别研究，揭示人体内蝶呤类化合物的代谢变化规律，尽可能为癌症的筛查和早期诊断提供一种更为敏感有效的方法。

蝶呤类化合物是一类重要的代谢标志物，涉及到人体内的多个生化过程，其体液水平被认为是一个潜在的癌症诊断指标。然而，蝶呤化合物的检测是当前研究的难点，如该类化合物存在不同的氧化阶段，尤其是还原态极易氧化、体液中组分众多而含量甚微（微摩尔至纳摩尔水平） 等。根据蝶呤化合物强极性水溶性的特点，传统的反相色谱难以保留此类化合物，本项目首先使用5种不同类型的亲水相互作用色谱对12种蝶呤化合物进行了保留机制的研究，从流动相组成，缓冲盐类型，pH值，盐浓度等多个方面进行了全面的的考察，首次阐明了这类化合物在多种亲水作用色谱上的保留机理，并筛选出了最佳保留色谱柱和保留条件。以此为基础，建立了亲水相互作用色谱串联质谱同时检测多种蝶呤化合物的分析平台，采用“dilution and shoot”的前处理方法完成尿液样本的预处理。方法验证结果表明该平台测定蝶呤代谢物的数据稳定、可靠，方法简单、快速，完全能满足后续临床样本的分析要求。该方法可以同时实现高氧化态、二氢及四氢蝶呤的检测，克服了传统荧光检测器不能同时分析蝶呤化合物多种氧化态形式的缺点。利用此分析平台，本课题组检测了健康对照组、良性卵巢肿瘤组和恶性卵巢肿瘤组的尿液样本共计72例，探讨了肌酐、尿比重和肌酐-比重联用的不同校正法抵消尿液个体差异的影响，利用PCA和OPLS-DA多变量统计分析方法建立了三组样本的识别模型，结果显示恶性卵巢肿瘤组能与健康对照组、良性卵巢肿瘤组相区分，其中蝶呤、四氢生物蝶呤、黄蝶呤、二氢新蝶呤和新蝶呤在恶性肿瘤与对照组间的差异最显著（VIP>1）。本研究在发现卵巢癌潜在代谢标志物的同时，也为蝶呤化合物的相关临床转化研究提供了重要的技术支持。