microRNA介导的线粒体DNA损伤对核基因的逆行调控在化学物致癌过程中的分子机制研究

在已完成国家基金项目中发现，线粒体DNA（mtDNA）损伤改变了转录因子的表达和信号途径而对核基因进行逆行调控是化学物致癌的分子机制。新近我们发现mtDNA损伤后microRNA（miRNA）表达谱明显改变，目前尚未见相关内容报道。本研究提出miRNA介导的mtDNA损伤对核基因的逆行调控在化学致癌中的分子机制假说，拟采用致癌物作用于mtDNA缺失HepG2细胞，采用miRNA芯片、realtime PCR筛选出分别受mtDNA和核基因调控的miRNA表达谱；生物信息学预测受mtDNA调控的miRNA的靶位点并加以验证；构建miRNA过表达、低表达载体研究miRNA与其靶位点及核基因的调控机制；分析化学物剂量、mtDNA损伤、miRNA表达与肿瘤表征的量效关系，明确miRNA介导的逆行调控在化学物致癌中的作用。本研究具有原创性，将为化学致癌机制提供新理论，为化学物致癌性评价提供生物标志物。

在短短的一年时间里，我们围绕微小RNA（miRNA）介导的线粒体DNA（mtDNA）损伤对核基因的逆行调控在化学致癌中的分子机制开展了探索性研究，主要工作成果有如下四个方面：第一，我们采用miRNA芯片筛选了mtDNA缺失HepG2细胞、线粒体功能抑制HepG2细胞和HepG2细胞三种细胞中miRNA表达的差异，结果发现，与对照组HepG2细胞比，mtDNA缺失HepG2细胞组有84个miRNA表达上调，188个下调（差异超过2倍）；线粒体功能抑制HepG2细胞组有113个表达上调， 229个下调；线粒体功能抑制HepG2细胞和mtDNA缺失HepG2细胞比较，miRNA表达上调的有153个，下调107个，表明mtDNA缺失和线粒体功能抑制均可引起miRNA表达的改变；第二，采用Real-time PCR对与肿瘤发生密切相关的hsa-miR-221*、miR-145、hsa-miR-9*、hsa-let-7、hsa-miR-224等miRNA表达差异进行了验证，结果与芯片结果基本符合；第三，应用DIANA-mirpath algorithm软件对差异表达miRNA的分子靶的预测分析显示，其主要调控途径是与肿瘤分化、增殖有关的MAPK和AP-2途径，与我们前期明确的mtDNA损伤对核基因的逆行调控的主要途径相一致，表明miRNA可能介导了mtDNA损伤对核基因的逆行调控，初步证实了我们的假说；第四，优化了mtDNA缺失的模型，我们筛选了大量mtDNA特异损伤剂，得到了他克林对mtDNA特异损伤，而对核基因无损伤，并对其细胞作用机制和其可能的拮抗剂作了筛选，建立了更加稳定且无溴化乙锭污染的mtDNA缺失的细胞模型。.综上，通过这一年的研究，我们证实了miRNA可能介导了mtDNA损伤对核基因的逆行调控的假说，为我们今后深入探讨化学物致癌的调控机制提供了可靠的证据和坚实的实验基础。