温肺化纤汤通过Notch信号通路增强BMSCs免疫抑制功能的机制研究

Idiopathic pulmonary fibrosis is a no effective treatment for the disease,Clinical practice has proved that Wenfeihuaxian formula has good effect on the patients with pulmonary fibrosis. Our previous research showed that Wenfeihuaxian formula can effectively promoted autologous bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) of rats repair damage cells to repair pulmonary fibrosis lesion. But this function can not fully explain the pharmacological effect of Wenfeihuaxian formula. Recent research suggested that BMSCs unique immunomodulatory functions may play important role in this process . Notch signaling is a classic and conservative growth regulatory pathway, Therefore, we propose "Wenfeihuaxian formula may promote immunomodulatory ability of BMSCs by regulating Notch signaling" hypothesis. To confirm this hypothesis, This research plan to observe the BMSCs impact on immunophenotype of T lymphocytes in pulmonary fibrosis microenvironment using qRTPCR、ELISA and flow cytometry et al. The influence of Wenfeihuaxian formula is also be observed.

特发性肺纤维化是一种尚无有效治疗手段的疾病，临床证实温肺化纤汤对肺纤维化患者有较好的疗效。我们前期研究证实温肺化纤汤能够促进骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）替代受损细胞，从而减轻肺间质肺纤维化程度，但这一作用不能完全解释该方的药理作用。最新的研究发现BMSCs具有很强的免疫调节能力，而Notch信号通路在其中扮演着重要角色。据此，我们提出“温肺化纤汤可能是通过Notch信号通路增强BMSCs免疫抑制功能”的假说。为证实该假说，本研究拟运用流式细胞术、qRTPCR、ELISA等技术，采用体内和体外实验相结合，研究肺纤维化微环境中淋巴细胞免疫表型、转录因子表达和因子分泌，观察温肺化纤汤干预后，BMSCs在体内外的免疫调节功能，并分析Notch信号通路在其中的作用及其分子机制，本项目可更清晰地阐释该方治疗肺间质纤维化的分子机制。

本项目研究结果显示，肺纤维化大鼠的支气管灌洗液有CD40等10种细胞因子与健康对照组相比存在显著差异。进一步的实验证明肺纤维化大鼠的支气管灌洗液可以诱导BMSCs定向分化为Ⅱ型肺泡细胞，而温肺化纤汤含药血清可以显著提升转化率，这与激活BMSCs的MAPK信号转导通路的相关基因有关，总共有24个基因表达有显著变化，其中明显上调的基因10个，明显下调的基因14个。采用温肺化纤汤含药血清干预48h后，和支气管灌洗液组比较，基因芯片结果显示Pdgfb、Fgf16和Pdgfra等3个上调基因和Arf2、Braf、Chuk和Rasa1等4个下调基因有显著变化。将大鼠BMSCs的体外分离、扩增和鉴定，并和大鼠支气管肺泡灌洗液T淋巴细胞共培养，我们发现与健康对照组大鼠比较，肺纤维化组和温肺化纤汤低剂量组大鼠支气管肺泡灌洗液中的CD3+、CD8+无显著性差异，而CD4+和CD4+/CD8+比值均显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与肺纤维化组大鼠比较，温肺化纤汤中剂量组和温肺化纤汤高剂量组大鼠支气管肺泡灌洗液中的CD3+、CD8+无显著性差异，而CD4+和CD4+/CD8+比值均显著降低增高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。采用qRTPCR方法在mRNA水平上检测BMSCs表达NotchmRNA水平。结果显示，与空白对照组相比，T淋巴细胞组、T淋巴细胞+温肺化纤汤含药血清组低剂量组、中剂量组和高剂量组的BMSCs Notch mRNA水平显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。本项目的完成，能够验证我们提出的“温肺化纤汤可能是通过Notch信号通路增强BMSCs免疫抑制功能”的假说。这些研究结果有助于深入阐释温肺化纤汤组方的科学内涵，并为其临床应用提供更多的科学依据。