温肺化纤汤介导Wnt经典信号通路调控骨髓间充质干细胞向Ⅱ型肺泡细胞分化的机制研究

Clinical studies have confirmed that Wenfeihuaxian formula has good curative effect on pulmonary fibrosis. The lab research showed that Wenfeihuaxian formula can effectively mobilized autologous bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) of rats migrating to repair pulmonary fibrosis lesion after BMSCs planting in the lung. But the procedure of how BMSCs differentiate into target cells to replace the damaged cells is still unclear. The type Ⅱ alveolar cell is main stem cells in lungs.The type Ⅱ alveolar cell's proliferation and differentiation into type I alveolar cells are only way to repair lung injury. Wnt classic signaling pathway plays an important role in the differentiation of BMSCs. Therefore, we propose "Wenfeihuaxian formula promote differentiation of BMSCs into type II alveolar cells by inhibiting Wnt classic signaling pathway activates the transcription of downstream target genes" hypothesis. This research plan to establish the SD rat pulmonary fibrosis model jointed with GFP-BMSCs. Then we will screening the target genes in Wnt classic signal pathway which regulate BMSCs differentiate to type Ⅱ alveolar cells by using PCR gene chip and Western blot. We also reveal the role of Wnt classic signaling pathway in that process by investigating the Wenfeihuaxian formula intervention on expression and biological activity of key genes in Wnt classic signaling pathway. So we will provide objective experimental clinical evidence for Wenfeihuaxian formula.

临床研究证实温肺化纤汤治疗肺纤维化疗效显著，基础研究显示其能动员大鼠自身骨髓间充质干细胞（BMSCs）向病变部位迁移，发挥修复作用。但BMSCs在肺部定植后，如何分化为目标细胞以替代损伤细胞的过程不清楚。Ⅱ型肺泡细胞增殖并向Ⅰ型肺泡细胞转分化是肺损伤修复的唯一途径，Wnt经典信号通路在BMSCs分化中起重要作用。据此，我们提出"温肺化纤汤可能通过抑制Wnt经典信号通路激活下游靶基因的转录，促进BMSCs向Ⅱ型肺泡细胞分化"的假说。本研究引入GFP转基因BMSCs嵌合SD大鼠模型，运用基因芯片、Western blot 等技术，采用动物和细胞实验相结合，筛选Wnt经典信号通路中调控BMSCs向Ⅱ型肺泡细胞分化过程中的靶基因；观察温肺化纤汤干预Wnt经典信号通路相关因子的表达和活性，揭示Wnt经典信号通路在BMSCs向Ⅱ型肺泡细胞定向分化中的作用及温肺化纤汤的调节机制，为临床应用提供实验依据。

本项目是在前期基础上，验证我们提出的“温肺化纤汤可能通过调节肺间质纤维化微环境中细胞因子的浓度来调控BMSCs的定向分化”的假说,主要研究内容有：分离纯化的大鼠BMSCs，观察温肺化纤汤对BMSCs增殖和迁移能力的促进作用；肺纤维化大鼠支气管灌洗液诱导BMSCs分化成Ⅱ型肺泡细胞，筛选差异表达基因建立GFP-BMSCs嵌合大鼠肺纤维化模型模型；观察温肺化纤汤干预的影响，温肺化纤汤对H2O2诱导大鼠肺间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用机制；卫矛化学成分的分离纯化和活性评价。. 本研究结果显示肺纤维化大鼠的支气管灌洗液可以诱导BMSCs定向分化为Ⅱ型肺泡细胞，而温肺化纤汤含药血清可以显著提升转化率，这与激活BMSCs的MAPK信号转导通路的相关基因有关，总共有24个基因表达有显著变化，其中明显上调的基因10个，明显下调的基因14个。采用温肺化纤汤含药血清干预48h后，和支气管灌洗液组比较，基因芯片结果显示pdgfb、Fgf16和Pdgfra等3个上调基因和Arf2、Braf、Chuk和Rasa1等4个下调基因有显著变化，其结果需要后续动物实验结果验证。. 随后课题组成功建立GFP-BMSCs嵌合大鼠肺纤维化，下图显示GFP-BMSCs可以在造模第4天聚集在肺损伤部位，并分化为Ⅱ型肺泡细胞。采用温肺化纤汤连续干预28天，HE和Masson染色均显示温肺化纤汤能够显著减轻博来霉素造成的肺纤维化损伤。.体外实验我们模拟肺纤维化的低氧环境，结果显示温肺化纤汤可以激活过氧化氢诱导的大鼠肺间充质干细胞的Akt蛋白磷酸化，促进Nrf2质蛋白和核蛋白表达，提高下游二相解毒酶HO-1的表达，从而平衡细胞内氧化/抗氧化系统，而具有抗氧化损伤作用。. 卫矛是温肺化纤汤中的关键药味，但是研究结果很少，本研究对卫矛的化学成分进行了系统分离纯化，对其主要成分的质谱裂解途径进行了研究，成功建立卫矛的质量控制标准，为后期研究奠定了扎实的基础。