ClC-3调控P-gp介导肿瘤细胞耐药的研究

ClC-3是容积激活性氯通道的通道蛋白或调节蛋白，多药耐药基因MDR1的表达产物P-糖蛋白（P-gp）也参与了容积激活性氯通道的调节，但两者之间的关系尚未明确。我们前期实验发现ClC-3 mRNA在耐药细胞株中高表达，其作用可能与正向调控MDR1表达有关，提示ClC-3可能通过调控P-gp介导了肿瘤细胞的耐药。本项目拟利用细胞生物学、分子生物学和免疫学等方法进一步深入研究，首先检测ClC-3在耐药与非耐药肿瘤细胞中蛋白水平的表达差异，并分析其与P-gp表达的相关性；进而观察ClC-3表达干预对肿瘤细胞耐药以及P-gp表达的影响，确定ClC-3在肿瘤细胞耐药中的重要作用；最后通过对ClC-3调控P-gp机理的探讨，明确ClC-3蛋白介导肿瘤细胞耐药的分子机制。项目的实施有望为ClC-3蛋白功能的认识提供新的学术见解，也将为探讨肿瘤耐药的机制和基于逆转肿瘤耐药的肿瘤治疗提供新的思路。

本研究利用细胞生物学、分子生物学、免疫学和病理学等方法探讨ClC-3氯通道蛋白在肿瘤细胞耐药中的重要作用并分析其介导肿瘤细胞耐药的分子机制。结果显示：①耐药细胞株的P-gp和ClC-3的表达均比非耐药细胞株高，两者呈正向直线相关。②ClC-3过表达促进肿瘤细胞耐药，ClC-3表达沉默则增加细胞对药物的敏感性。③用紫杉醇和阿霉素进行抗肿瘤治疗， MMTV-PyMT/CLCN-3双转基因小鼠比MMTV-PyMT单转基因小鼠的肿瘤生长抑制率低。④ClC-3过表达增加肿瘤细胞P-gp的表达，ClC-3表达沉默则降低细胞P-gp的表达。⑤MDR1过表达或是表达沉默都不能明显影响细胞ClC-3的表达。⑥MMTV-PyMT/CLCN-3双转基因小鼠肿瘤组织的MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达水平明显高于MMTV-PyMT单转基因小鼠。⑦ClC-3过表达使肿瘤细胞IKKα和IKKβ蛋白的表达量增加，IKBα蛋白表达量减少，促进NF-κB P65转移入细胞核，转录活性增高。⑧ClC-3过表达后再抑制NF-κB通路，细胞的P-gp表达降低，对药物敏感性增加。⑨ClC-3与P-gp能共定位与细胞膜，免疫共沉淀结果提示二者不能相互结合。本研究确证了ClC-3氯通道蛋白在肿瘤细胞耐药过程中发挥了重要作用，其机理是通过激活NF-κB信号转导通路来上调P-gp的表达，从而介导肿瘤细胞耐药。