基于杂交测序原理构建的电化学冬虫夏草基因鉴别传感器的研究

Because of genetic detection technology is of great application value in the study of Cordyceps sinensis identification. This topic will study on the construction of electrochemical DNA sensor for Cordyceps sinensis gene identification based on sequencing by hybridization theory. Compared with method of molecular biology which are currently used in Cordyceps sinensis detection, this sensor can identify Cordyceps sinensis gene sequencing directly through hybridization reaction, which has been proved to be a simple operation, as well as fast and cheap. We will synthesis of the corresponding complementary DNA electrochemical probe according to the specificity of the cordyceps sinensis gene sequence. The Probe containing all or part of the complements cordyceps gene sequence will only bind with the genes of Cordyceps sinensis and can not to falsify gene.The resulting hybrid on the electrode surface cause the change of electrochemical signal and the signal changes for the target sequence of qualitative and quantitative analysis.We expect to use the technology to construct one or two types of electrochemical Cordyceps sinensis gene identification sensor with the function of Identification of multiple falsify.

由于基因检测技术在冬虫夏草的真伪鉴别研究中具有极其重要的应用价值。本课题将研究基于DNA杂交测序原理构建冬虫夏草的电化学中药材基因鉴别传感器。相较于目前应用于冬虫夏草的基因检测的分子生物学方法，这种传感器能够通过DNA杂交反应对中药材基因进行直接测序鉴别，且具有操作简单，快速，廉价等优点。我们将根据冬虫夏草的特异性序列合成对应的互补电化学探针DNA，探针包含全部或部分与冬虫夏草基因互补序列，该探针只会通过碱基配对原理与冬虫夏草的基因片段发生杂交（不能与伪品的基因片段发生杂交），所形成的杂交体在电极表面引起电化学信号的改变，信号变化的大小用于目标序列的定性，定量分析。我们期望利用该技术构建出一到两款具有一次性区别多个伪品功能的电化学冬虫夏草基因鉴别传感器。

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏菌Cordyceps sinensis(Berk)Saec．寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。夏初子座出土，孢子未散时取出，晒至六七成干，除去附着物及杂质，晒干或低温干燥。冬虫夏草在中国主要分布在青海（产量占70%左右）、四川、西藏、云南和甘肃等省。由于价格高、生长环境特殊性和自然资源有限，冬虫夏草资源被过分采挖，生态系统严重受损，己濒临枯竭。然而，人们对冬虫夏草的需求量日趋上升以及求大于供，导致冬虫夏草的价钱飙升。非法商人为追求高额利润，以假乱真、以次充好，致使市场出现混乱。本课题基于DNA杂交测序原理构建冬虫夏草基因的电化学DNA传感器，并应用于冬虫夏草及其伪品的基因鉴别，还将合成具有优良的电化学活性的材料用做标示物及电极修饰材料，以提高传感器的灵敏度。这种传感器能够通过杂交反应对冬虫夏草基因进行直接测序。.①合成了一种新型四二茂铁信号标记。然后利用CHA和四二茂铁的信号放大策略构建了基于无试剂三链DNA的电化学DNA传感器。四二茂铁标记的发夹探针通过连接链整合在一起形成三链复合体。它在检测过程中无需添加外源探针即可引发催化发夹组装（CHA）反应，靶点的构象变化引起电化学信号的变化。这种构型的探针在众多电化学DNA传感器研究工作中是少有的。.②制备了一系列新型碳基纳米复合材料并将其应用于修饰电极，为构建高灵敏度的冬虫夏草基因传感器提供了一个优良导电性的基底。.③基于杂交测序原理，构建了电化学冬虫夏草基因鉴别传感器，为电化学传感器技术检测冬虫夏草提供新的思路。.项目提出的基于杂交测序原理构建的电化学基因鉴别传感器，成功开发了高效快速的中药材基因鉴别方法。DNA碱基之间特异性互补（A-T,G-C）的原则大大提高了传感器的特异性，目标循环策略的应用、新型信号标记物以及碳基纳米复合材料的合成与制备显著提高了信号放大效率。所构建的传感器平台具有更高杂交识别效率和灵敏度，这在电化学DNA传感器的研究中具有开拓性。发表了SCI论文10篇。申请人为第一完成人，获得2019年江西省自然科学二等奖，项目名称“基于生物传感技术的中药质量控制方法研究”，Z-19-2-10-R01。获得2021中华中医药学会科学技术三等奖，项目名称“基于电化学生物传感技术的中药质量控制方法研究”，202103-03-R-01。