基于杂交指示剂激发态性质构建新型DNA电化学传感器

本项目利用杂交指示剂与ssDNA结合和与dsDNA结合后光学性质的不同以及其处于基态和激发态时电化学性质的不同，构建基于杂交指示剂激发态性质的新型DNA电化学传感器。由于目标杂交指示剂与ssDNA结合产物和与dsDNA结合产物结构不同，而导致荧光参数不同，因此，可以通过控制激发光波光选择性地使与dsDNA结合的指示剂分子到达激发态。由于相对于基态，激发态物质的氧化电位较负（或还原电位较正），通过控制电位信号值使仅处于激发态的物质被氧化（或还原）。这样一方面避免了与ssDNA非特异性结合的杂交指示剂产生背景电化学信号而导致灵敏度低、选择差的问题；另一方面，以激发态物质为杂交指示剂可以防止DNA探针在过高电位或过低电位下被氧化还原而造成损伤，也可以保证DNA探针分子在电极表面的牢固固定，提高杂交效率，进一步提高检测的灵敏度。

本项目进行分三个阶段：.第一阶段，按照本项目原定方法，考察可以嵌插入dsDNA双螺旋结构中荧光分子的激发态电化学性质。结果显示，荧光分子经光激发后，其电化学行为没有明显改变，原因可能是激发态荧光分子的寿命较短，而电化学过程需经历物质扩散和电子交换过程，需要相对较长时间，故目前所用的电化学仪器和电极不能捕捉到最大量的激发态分子。所以项目尝试通过改变实验条件来延长荧光分子激发态寿命以及采用快速扫描伏安法来提高随后的电化学反应速度，以解决两步反应速度不匹配的问题。.第二阶段，一些自身没有荧光性质的物质嵌插进入dsDNA双螺旋结构中间时，由于其平面刚性增强而表现出强的荧光性质，基于此一些荧光分析方法被应用于DNA的检测。但是由于荧光自身的光散射、光漂白等缺点使其用于DNA测定时灵敏度受到影响，为了解决这些问题本项目建立了一种新的能量转移电化学发光方法，即当杂交指示剂分子与ssDNA结合时，其接受激发态鲁米诺的能量但不能被激发，或激发态分子不能以光辐射的形式释放能量而导致发光信号较低，而其与dsDNA分子结合时，由于刚性平面结构的增强，其吸收了激发态鲁米诺的能量达到激发态。能量转移电化学发光信号与嵌插进入dsDNA双螺旋结构中间的杂交指示剂分子的量相关，而嵌插进入dsDNA双螺旋结构的杂交指示剂的量又与DNA的杂交程度是相关的，基于此建立了一种非标记的能量转移电化学发光测定DNA的新方法。项目考察了多种可嵌插入dsDNA双螺旋结构中的荧光物质与激发态鲁米诺能量转移行为。这些物质包括三类：第一类为三苯甲烷类染料，如结晶紫、孔雀石绿、溴甲酚绿等；第二类为金属配合物，如联吡啶钌及其衍生物；第三类为荧光纳米粒子，如碳量子点。结果发现结晶紫、孔雀石绿和联吡啶钌作为插入剂时此电化学发光能量转移法可以很好的用于区分单双链DNA，并基于此建立了几种测定DNA的方法。.第三阶段，因电化学反应产物稳态扩散时，扩散层厚度为10-100μm，即在距电极10-100μm范围内，都可存在电化学反应产物从而产生激发态的发光体，本项目发现电化学发光能量转移法可检测长链DNA，突破荧光能量转移法及电化学方法检测DNA时对链长的限制。此外，因杂交指示剂与ssDNA和与dsDNA结合产物结构和所处微环境的不同，激发态发光体将能量选择性的转移给与dsDNA结合的杂交指示剂，可避免非特异性结合指示剂的背景信号。