MODYx家系Isl-1基因E283D错义突变的致病作用与机理研究

MODY gene spectrum varies remarkably among different races. Most MODY patients in China are caused by unknown MODY genes i.e. MODYx. Islet-1 (Isl-1), an insulin gene enhancer binding protein which belongs to LIM homeobox gene family, is an important transcription factor that involves in differentiation and development of pancreas as well as the expression of insulin gene. By screening genetic mutations of Isl-1 gene in MODYx families (n=96), which were previously identified as negative for the known six MODY genes, we found a missense mutation of E283D (A→T). Functional study showed that transcriptional activity of E283D mutant protein in insulin gene is 51.2% lower than that of wild type. In this study, combining with earlier clinical phenotype studies and results of function analysis in E283D mutation families, by using Isl-1-E283D mutation gene knock-in mouse model, we will explore E283D mutation in the following aspects: 1. its effects on development and function of mouse pancreas; 2. how it affects expression of glycometabolism relative genes; 3. how over-expression of Isl-1 in gene knock-in mice will reverse or relieve diabetic phonotypes. In this way, we could provide significant evidence in translational medicine and insights of molecular mechanisms through which E283D mutation involves in regulation of glycometabolism and targets of gene therapy.

种族间MODY基因谱差异极大，中国人大部分MODY型糖尿病系因未知MODY致病基因(MODYx基因)所导致。Isl-1属于LIM同源盒基因家族，是参与调控胰腺/胰岛分化、发育以及胰岛素基因表达的重要转录因子。我们对前期研究中确定的已知六种MODY亚型阴性家系即MODYx家系(n=96）进行Isl-1基因突变筛查，发现1个E283D错义突变家系。功能研究显示，与野生型相比E283D突变蛋白导致胰岛素基因转录活性下降51.2%。本项目我们将通过Isl-1-E283D突变基因敲入小鼠模型，结合前期该突变家系临床表型和功能解析结果，研究E283D突变：1.对于小鼠胰腺发育和功能的影响；2. 对于糖代谢相关基因表达的影响；3.基因敲入小鼠中Isl-1过表达对于糖尿病表型的逆转、缓解作用。为阐明E283D突变参与MODY型糖尿病糖代谢调控的分子作用机理及基因制药靶点提供转化医学的重要依据与思路。

青少年的成人型糖尿病（MODY）基因谱在种族间差异极大，中国人MODY患者大部分系因未知MODY基因(MODY-X)突变所致。ISL1是参与调控胰腺/胰岛分化、发育以及胰岛素基因表达的重要转录因子。我们在前期MODY-X家系的ISL1基因突变筛查中发现与糖尿病呈遗传共分离的E283D突变。功能研究显示，E283D突变体蛋白导致胰岛素基因转录活性下降51.2%。因此, 我们提出ISL1可能是MODY新致病基因的假说。本项目完成ISL1-E283D突变小鼠模型制作并建系。发现与野生型（WT，n=8）相比，无论杂合（ISL1-E283D+/-，n=6）还是纯合突变（ISL1-E283D+/+，n=6）小鼠，生后60天血糖增高，90天糖耐量试验（IPGTT）显示二者均发生糖尿病；140天和200天IPGTT和胰岛素耐量试验（IPITT）显示二者血糖进一步升高，胰岛素分泌由高转向“正常”，但0、30、120分钟胰岛素与血糖比值显著降低。240天小鼠空腹取材研究显示, 杂合和纯合突变小鼠血糖显著增高、胰岛素与胰高糖素比值显著降低（p﹤0.01）。小鼠胰腺转录组测序研究表明，与其它信号通路相比，ISL1-E283D主要引起MODY通路基因的差异表达（p=3.11e-11），导致MODY转录因子调控网络信号通路（KEGG pathway map 04950）的重要转录因子Foxa2和Pdx-1以及胰岛素mRNA的减少，胰高糖素mRNA的显著增高。同时,免疫组化、Western blot实验证实，该突变导致胰岛素蛋白表达降低和胰高糖素蛋白显著增高。以上ISL1-E283D转基因小鼠整体水平研究提示，与小鼠胰腺发育和胰岛素表达调控显著相关的信号通路转录因子Foxa2和Pdx-1的mRNA下调、胰岛素转录与蛋白表达降低和胰高糖素转录与蛋白表达的增高，是ISL1-E283D突变导致糖尿病表型的致病机制。通过MODY-X家系ISL1-E283D突变的发现、突变转基因小鼠模型建立及系列致病机制研究，我们提出ISL1-E283D突变可导致胰岛素分泌减少的、胰岛β细胞功能缺陷的MODY型糖尿病，为阐明该突变参与MODY糖代谢调控的分子机制及基因制药靶点提供了转化医学的重要依据与思路。因此，我们提出并证实了一个新的MODY-X致病基因ISL1的诞生！