姜炭止血药效物质基础及炮制机理研究

"炒炭存性"是炭药炮制理论的集中体现，但其机理研究处于"暗箱"状态，即体内过程不清楚；目前用中药其中的一个或数个成分进行药动及药动-药效相关性研究，未能完整真实地反映中药的体内过程。干姜/姜炭药效各异，是"炒炭产生止血作用"的典型范例。本课题是在前期对姜炭化学成分、工艺、药效初步研究的基础上，采取"中药化学-血清化学-药动学-药效学-人工神经网络"的研究模式，对姜炭进行系统的化学研究；建立虚寒性出血证大鼠模型，利用UPLC-MS鉴定给药后血清中成分的结构（原型成分和代谢产物）；对体内各成分进行药动-药效相关性研究；利用人工神经网络对各成分的药动-药效学参数进行处理，建立干姜/姜炭的PK-PD模型。通过对体外化学成分的变化、体内成分的吸收代谢及其与药效的相关性的比较，确定姜炭止血的药效物质基础，揭示"炒炭存性"的科学内涵，进而阐明姜炭的炮制机理，为炭药研究提供新的研究模式和思路。

干姜姜炭“一物两性”，炮制前后药性各异，炮制机理不明。本实验首先以吸附力、鞣质、6-姜辣素和6-姜烯酚含量为指标，采用星点设计方法，优化出姜炭最佳炮制工艺；从吸附力、鞣质、pH方面确定姜炭的质量标准，并同时进行药效学验证。对姜炭进行化学成分的系统分离，鉴定16个化合物，均首次从姜炭中得到，其中4个成分是姜炭炮制后产生的新成分。采用HPLC-DAD-ESIMS方法对干姜、炮姜、姜炭进行指纹图谱和6个成分同时含量测定，采用PCA、HCA、ANOVA、Similarity 等化学计量学方法，比较分析姜炭炮制前后化学成分的变化，并同时对姜炭不同炮制程度（轻炭、标炭、重炭）、不同厂家的姜炭进行质量分析，结果表明所建立的方法，具有较好的特征性、专属性和实用性。同时结合UPLC-MS方法，对干姜/姜炭炮制过程中成分裂解规律进行分析。针对姜辣素类成分不稳定，建立一测多评法同时测定干姜中4种姜酚类成分的含量的方法，为干姜/姜炭药材质量评价提供新方法。药效学方面，在优化确定虚寒性出血症模型的基础上，比较干姜姜炭对凝血五项、血栓素、6-酮-前列腺素F1α、凝血时间、血液粘度、优球蛋白溶解时间的作用，结果表明姜炭对各指标均具有较好的治疗作用，而干姜较弱。体内研究方面：采用HPLC方法比较干姜姜炭灌胃给药后大鼠血清和尿液中化学成分的不同，确定药物进入体内化学成分，为药代动力学研究提供科学依据；同时采用NMR方法分析内源性成分变化，确定姜炭温经止血的内源性药效生物标志物，为姜炭温经止血的整体药效学评价提供新的方法。对干姜/姜炭进入血清中成分进行药代动力学研究，结果发现干姜/姜炭炮制前后、在正常大鼠和虚寒性出血大鼠的药动学曲线和药动学参数有显著不同，说明在不同的生理病理状态下，机体对药物成分的吸收代谢不同；姜炭炮制前后在体内的吸收、作用过程也不相同。药效动力学研究结果发现，以TXB2和TXB2 /6-Keto-PGF1α为指标，姜炭各个时间点对虚寒型出血症具有较好的矫正作用，而干姜组效果不明显。采用人工神经网络对干姜姜炭进行多成分多药效指标的PK-PD相关性分析，并且利用该模型，分析各成分对药效的贡献率，确定姜炭止血药效物质。同时分别以贡献率、AUC0~∞为权重，建立干姜/姜炭整体药代动力学，从整体上阐明姜炭炮制前后体内作用过程的不同，进而阐明姜炭炮制机理，为炭药研究提供新的研究模式和思路。