血红素加氧酶-1/一氧化碳信号系统通过延缓GSH耗竭介导苜蓿镉耐性的分子机理及其应用

血红素加氧酶/一氧化碳（HO/CO）是动物中新发现的一种信号系统，具有调节重金属稳态和抵御各种胁迫的功能,但是不清楚其在植物中的生理功能。最近我们发现，低浓度镉通过诱导苜蓿HO-1表达释放的CO可以提高镉耐性，并与其延缓GSH耗竭有关(New Phytologist, 2008)。本课题将从苜蓿中克隆HO-1基因，分析其序列特征和类型；构建HO-1过表达和RNA干涉（RNAi）载体，获得HO-1过表达和基因沉默的转基因苜蓿；并利用转基因苜蓿结合药理学实验评价HO-1/CO系统与GSH稳态和NO信号的关系，以及在典型镉污染土壤中的耐性。将HO-1基因分别导入拟南芥的4个HO突变体，得到转基因纯合子后观察GSH稳态以及对镉耐性的表型是否恢复；采用β-环糊精包埋技术来改善HO-1活性诱导剂氯化血红素的实用性，并应用于提高植物的耐镉性。上述结果对阐明HO-1/CO调节植物镉耐性具有重要意义。

动物血红素加氧酶/一氧化碳（HO/CO）是一种重要的内源气体信号系统，但其调控植物对重金属抗性方面的研究还比较少。本项目的研究结果如下：（1）从紫花苜蓿中克隆到HO1基因，并命名为MsHO1，其全长cDNA为852 bp，预测蛋白含有283个氨基酸，分子量为32.8 kD；此外，还克隆得到了MsHO1的基因组序列，经分析其包含4个外元和3个内元；并分析了其亚细胞定位和生化特性及其诱导表达谱；（2）镉胁迫引起的谷胱甘肽耗竭诱导了MsHO1表达，巯基耗竭剂马来酸二乙酯处理模拟镉对谷胱甘肽的耗竭得到相同结果；镉和巯基耗竭剂诱导的MsHO1表达能被谷胱甘肽合成抑制剂BSO加强，并被外源添加GSH处理逆转；抑制剂实验结果表明谷胱甘肽耗竭诱导的MsHO1表达至少在转录水平受到调节；（3）MsHO1诱导剂水杨酸通过维持谷胱甘肽、抗坏血酸和NAD(P)H在内的氧化还原稳态来缓解镉胁迫，并降低紫花苜蓿根部的镉含量，且上述效应具有MsHO1依赖性；水杨酸处理的缓解作用可以被HO1抑制剂ZnPPIX所阻断，并被HO1催化产物CO回补；同时发现，紫花苜蓿中除谷胱甘肽外还含有大量的同型物——同型谷胱甘肽，正常情况下同型谷胱甘肽含量是谷胱甘肽8倍左右，且在应对镉胁迫中发挥主要作用；（4）MsHO1诱导剂hemin的β-环糊精包埋物CDH不仅具有高水溶解性，而且其缓解镉伤害的最佳浓度仅为hemin的千分之一，从而具有良好的应用前景；（5）抗氧化剂抗坏血酸外源处理，不仅能缓解镉胁迫同时还上调MsHO1表达，HO1抑制剂ZnPPIX能逆转抗坏血酸的保护作用；（6）新发现的气体信号分子硫化氢能够调节同型谷胱甘肽代谢，上调活性氧代谢及相关基因表达，最终提高紫花苜蓿耐镉性；抑制剂实验表明硫化氢的保护作用与MsHO1有关；（7）硫化氢和一氧化氮在缓解镉胁迫中可能存在互作；（8）从紫花苜蓿中克隆到MsHO2基因；（9）完成了MsHO1过表达载体及RNAi载体的构建，以及紫花苜蓿遗传再生体系的建立；（10）遗传学角度证明拟南芥HO-1和耐镉性有关。上述结果已经在J Exp Bot等刊物上发表SCI论文7篇，国内核心刊物论文4篇，申请国家发明专利1份。总之，本研究结果不仅充实了HO/CO在植物对抗重金属镉胁迫中的生理功能，而且也为解决重金属镉污染的生产实践提供初步的理论依据。