植物糖转运蛋白作为糖基导向农药输送载体的研究

本实验室前期研究明确了在体外植物细胞水平上，糖基偶合物农药分子可以被葡萄糖转运蛋白转运。并通过烟草和蓖麻两种模式植物构建的双向输导性农药筛选平台，成功鉴定出具有良好输导性的农药。为了直接证明植物糖转运蛋白介导糖基偶合物农药的转运输导，本项目拟在上述研究基础上，开展植物糖转运蛋白在糖基导向农药输导及导向机理中的作用研究。根据烟草葡萄糖转运蛋白MST1的基因序列，构建MST1过表达烟草植株以及MST1基因过表达烟草和非转基因烟草的嫁接植株，然后采用色谱法研究具双向输导性偶合物在此两种植株上的吸收、输导和分布。通过吸收分布的差异，明确烟草葡萄糖转运蛋白MST1过表达能够影响糖基导向农药在植物体的转运与分布，证实糖转运蛋白是糖基农药在植物体内转运载体之一，植物对糖基农药的转运可以为主动运输形式，阐明农药在植物体内新的输导方式，为新型农药的研发提供新的研究思路和理论基础。

本项目构建了不同糖基、不同连接位点、不同连接方式和不同农药母体等一系列化合物，并研究了其韧皮部输导性。研究结果表明糖基种类、连接位点、连接方式和农药母体对糖基导向农药输导性差异明显，也说明糖基导向农药的吸收转运中有载体的参与。在转运蛋白研究方面，通过电击法构建了异源表达单糖转运蛋白RcHEX3的酵母菌株和含有mst1和RcHEX3基因的农杆菌克隆，采取农杆菌介导的稳定转染方法构建烟草单糖转运蛋白过表达的悬浮细胞系和RcHEX3大豆复合植株。酵母吸收实验表明，与空载酵母相比较，异源表达RcHEX3基因的酵母体内的荧光更强，说明FPGN可以在单糖转运蛋白的介导下进入细胞；通过浸根法研究糖基氟虫腈在大豆体内的长距离输导性，结果表明：实验1h、2 h后，转基因复合植株的根部GTF含量大于空载复合植株的含量，差异显著；施药12 小时后，空载植株和35S::RcHEX3植株上部茎GTF含量差异显著，根部和下部茎差异不显著。将RcHEX3过表达大豆离体毛根在含50μM或100μM FPGN培养液中1 h或2 h后，通过激光共聚焦扫描显微镜，观察FPGN在大豆离体毛根中的转运情况。结果显示部分FPGN位于皮层和内皮层的细胞壁和细胞间隙，部分位于皮层和内皮层的细胞内；而侧根部位的FPGN则主要位于细胞内，说明FPGN可能通过质外体途径和共质体途径两种方式进入根部。另外，从吸收机制和韧皮部输导性评价两个方面研究荧光标记基团NBD对母体化合物GTF的影响，证明了NBDGTF是一种合理的GTF的荧光替代物，可视化研究证明子叶能够通过表皮细胞直接吸收培养液中的NBDGTF，通过质外体-共质体转运途径装载到韧皮部筛管，并通过韧皮部向下胚轴进行运输。本项目直接证实了导向农药的重要构想，为糖基导向农药的进一步研究提供了理论基础。