Pirh2介导的核蛋白NP泛素化修饰在IAV感染中的作用机制

Influenza A virus (IAV) is highly susceptible to mutation and is difficult to control. IAV's RNA polymerase controls viral genome transcription and replication and is a key factor in determining viral infection and host tropism. Because of its relatively conservative, it has become a new anti-viral target. Protein post-translational modification (PTM) plays an important role in the IAV infection cycle, but how PTM regulates RNA polymerase function is not clear. We found that nucleoprotein NP is a potential substrate of Pirh2 E3 ligase and modified by ubiquitination. Therefore, we propose to study the interaction between IAV infection and Pirh2. Specifically, we will study the mechanism by which IAV infection regulates Pirh2 expression. Conversely, we will examine the effect of altered expression level of Pirh2 on IAV infection and replication. Finally, we will characterize the effect of Pirh2-mediated NP ubiquitination on NP protein stability, subcellular localization, binding to PB2 or RNA, as well as RNA polymerase activity, to uncover the regulatory mechanism of Pirh2 on NP protein. This study will not only help to understand the regulatory mechanism of Pirh2-mediated ubiquitination on IAV infection and replication and provide a theoretical basis for the discovery of antiviral candidates targeting RNA polymerase, but also serve as a valuable example for studying the role of PTM in IAV infection.

甲型流感病毒（IAV）极易突变，难以防治。IAV的RNA聚合酶控制病毒基因组转录与复制，是决定病毒感染和宿主嗜性的关键因子。因其相对保守，而成为了抗病毒新靶标。蛋白翻译后修饰(PTM)在IAV感染周期中起重要作用，但PTM如何调节RNA聚合酶功能尚不清楚。我们发现，核蛋白NP可能是E3泛素连接酶Pirh2的泛素化修饰底物。因此，本项目拟研究IAV感染与Pirh2的互作。首先，研究IAV感染调控Pirh2蛋白表达的机制；然后，研究改变Pirh2的表达对IAV感染与复制的影响；最后，从Pirh2介导的泛素化修饰对NP蛋白稳定性、亚细胞定位、结合PB2或RNA的能力，以及RNA聚合酶活性等影响，阐明Pirh2对NP蛋白的调节机制。这不仅有助于了解Pirh2介导的泛素化修饰对IAV感染与复制的调节机制，为发现靶向RNA聚合酶的抗病毒靶点提供理论依据，而且能为PTM对IAV的调节作用研究提供参考。

甲型流感病毒（IAV）的快速突变为制定预防和治疗策略带来了持续的挑战。甲型流感病毒（IAV）依赖病毒核糖核蛋白（vRNP）复合物调控病毒基因的转录与复制。每个vRNP复合体是由一个被多核蛋白NP包裹的病毒基因组RNA节段和一个三聚体RNA聚合酶复合物组成，调控病毒基因组转录与复制，是决定病毒感染和宿主嗜性的关键因子。因其相对保守，而成为了抗病毒新靶标。在本研究中，我们发现宿主蛋白E3泛素连接酶Pirh2与NP互作并介导NP在351位赖氨酸发生短链泛素化修饰，从而抑制NP-PB2相互作用以及vRNP复合物的形成。此外，我们还发现，Pirh2敲低能够促进IAV复制，而Pirh2过表达则抑制IAV的复制。重要的是，Pirh2-ΔRING（E3泛素连接酶活性缺失突变体）则不能抑制IAV的感染。此外，我们还发现，Pirh2对WSN-K351R（该病毒核蛋白NP 351位赖氨酸残基被精氨酸取代）的复制没有影响。有趣的是，通过分析2011年至2020年间所有人流感与禽流感核蛋白NP的氨基酸序列，我们发现26977株人流感毒株中99.18%核蛋白NP 351位编码赖氨酸，而9956株禽流感毒株中95.3%核蛋白NP 351位编码精氨酸。最后病毒感染试验表明，Pirh2敲除不影响H9N2-W1和H9N2-C1（NP 351位残基编码精氨酸）这两株禽流感病毒的复制。总的来说，我们证明了Pirh2是通过调节NP的短链泛素化来抑制IAV感染。值得注意的是，Pirh2靶向的NP 351位残基可能与禽流感病毒逃避人类抗病毒应答有关。这些发现将有助于更好地理解泛素修饰在IAV感染中的作用，并为抗病毒药物的开发提供理论基础。