雌激素调控TAK1基因表达在类风湿性关节炎发病中的作用和机制研究

Estrogen and transforming growth factor-β activation of protein kinase-1 (TAK1) are two important factors in the pathogenisis of rheumatoid arthritis(RA), but the interaction between estrogen and TAK1 remains unclear.We have reported that there was a statistically significantly higher mean TAK1 mRNA, protein expression and kinase activity in the knee joint synovial tissue of patients with RA vs patients with control. Moreover,we found that 17beta-estradiol(E2) can upregulate the expression of TAK1 mRNA in Fibroblast-like synoviocytes (FLS) of RA patients. Analysis of TAK1 gene promoter using TRANSFAC-TESS program indicated response elements-ERE and AP-1. Therefore, we infer that E2 improves the expression of TAK1 mRNA, at least in part through E2/ER-ERE and E2/ER-AP-1 pathways regulating TAK1 gene expression..In this study,we propose to 1)detect E2 regulating the expression of TAK1 gene in FLS of RA. 2)clarify the mechanism of E2/ER-ERE and E2/ER-AP-1 regulating the expression of TAK1. 3)construct the TAK1siRNA, dectect the expression of downstream proinflammatory cytokines. 4)detect the expression of TAK1 and downstream proinflammatory cytokines of synovial membrane in collagen-induced arthritis(CIA) rats. Our results may represent a new insights into the of pathogenesis of RA.

雌激素和TAK1与RA发病密切相关，但TAK1是否在雌激素的调控下影响RA发生尚未见报道。课题组发现，TAK1在RA病人滑膜组织中表达和活性升高；雌激素（E2）刺激RA病人滑膜细胞，TAK1表达水平上调、且TAK1启动子区存在与雌激素作用相关的反应元件ERE和AP-1，但具体调控机制有待研究。本项目拟深入探索E2通过E2/ER-ERE和E2/ER-AP-1途径参与调节TAK1基因表达的机制。首先体外实验鉴定E2在转录水平影响TAK1基因表达；然后证明E2/ER-ERE和E2/ER-AP-1途径在E2上调TAK1基因启动子活性中的作用；构建TAK1siRNA表达载体，比较E2作用下TAK1下游炎性因子表达水平的变化；最后构建CIA大鼠模型，检测E2作用下大鼠滑膜组织中TAK1基因及下游炎性因子的表达水平，体内验证上述机制。本研究为阐明RA的发病机制提供重要理论依据，为RA的治疗提供新靶点。

雌激素和TAK1都是与类风湿性关节炎发病相关的重要因子，但尚无有关雌激素对TAK1基因表达调控作用的报道。本研究分别从体外和体内鉴定了雌激素对TAK1基因表达水平的影响及其作用机制。一方面，我们收集了在中国医科大学附属第四医院行关节置换手术的10例女性RA患者的滑膜，采用组织块培养法进行FLS的原代培养，结果表明E2以浓度依赖方式上调TAK1 mRNA和蛋白表达水平；并且雌激素受体抑制剂ICI 182,780和转录抑制剂actinomycin-D可分别抑制这种上调，而蛋白合成抑制剂cycloheximide则否，提示E2以浓度依赖方式在转录水平调节TAK1 mRNA表达。随后，我们应用荧光素酶活性的方法鉴定了人TAK1基因-260 ~ -170 bp是主要的转录调控区，是进一步研究DNA结合蛋白的调控靶序列，并且在该区域内-243~ -234存在ER的反应元件ERE, E2作用增强ER蛋白与这个位点的结合,说明雌激素受体反应元件介导雌激素对TAK1基因表达水平的上调, 这可能是雌激素影响TAK1基因表达从而参与类风湿性关节炎发生的一种可能的分子机制。另一方面，我们构建了雌性大鼠的关节炎模型，建模后发现动物体重有所减低，足爪出现红肿，关节软组织肿胀，跗骨排列分散，跗骨周围可见骨赘，游离“关节骨”, 符合关节炎形态学改变，并且给予雌激素刺激的关节炎大鼠TAK1mRNA和蛋白表达水平高于生理盐水组和正常组，从体内验证了上述机制。本研究不仅对深入了解TAK1基因功能有重要意义，而且将为阐明类风湿性关节炎的发病机制提供重要的分子水平依据。