"肾为先天之本"藏象与肾虚家系的表观遗传研究

基于国家自然科学基金六项研究的积累，拟从大方向（藏象）→中间环节（遗传）→小发现（TLR）的三个层次立项。前期肾虚证研究集中于免疫和代谢类基因模块，尤其是家系双生子糖尿病的实验中，发现TLR等基因表达谱主要为大量下调，进而引入表观遗传学的方法，探索前期结果的机制，以利于深入揭示藏象的现代生物学基础。.精选3-5个典型的肾虚证糖尿病家系，将患者和正常人分别进行，表达谱芯片、甲基化芯片和miRNA芯片实验，选择启动子区域甲基化改变的差异表达基因，作其转录因子活性的检测以进一步验证，筛选与糖尿病肾虚证相关的DNA甲基化位点和候选miRNA；再作TLR等基因的定量PCR验证，及甲基化状态检测。.以信息融合等方法整合4类芯片数据，从TLR信号途径等多种角度分析肾虚证与先天性免疫的关系。研究3代人"肾为先天之本"的表观遗传调控的部分机制，丰富藏象学说的科学内涵，发展中医遗传学。

本课题组主要从以下三方面对2型糖尿病(T2DM)肾虚证的遗传学特性进行了研究：1.文献整理和理论探索研究：通过对中医典籍中对“消渴”相关论述梳理，总结出肾虚因素在消渴的发病中具有重要意义，提出肾虚证是消渴中的一个重要证型。在理论探索方面，本课题组认为，“肾为先天之本”在微观层面上体现了基因本身和基因转录调节两个方面。从经典遗传学层面来说，“肾为先天之本”体现在即基因本身改变对功能的影响；从表观遗传学来说，“肾为先天之本”体现在个体基因表达调节对功能的影响。2. T2DM肾虚证的流行病学调查：本课题组在本地区对793例T2DM患者进行相关流行病学调查，在前期肾虚量表的基础上，通过专家现场辩证和多次校正后采用量表评分对肾虚证型进行筛选研究发现，在临床上肾虚证为T2DM的主要证型之一，随着年龄增加，T2DM发病增高，提示年老肾虚为T2DM发病的重要因素；统计学结果显示具有T2DM家族史的肾虚患者的比例明显高无家族史肾虚患者比例，提示T2DM肾虚证具有一定的家族聚集趋势。3. T2DM肾虚证基因表达谱和miRNA表达谱研究：通过对肾虚组与非肾虚组的表达谱发现，肾虚组与非肾虚组的表达谱对比有上调基因45条，下调基因61条。这些基因富集分别为：分子功能、细胞组成和生物学过程，由此推测“肾虚”因素可能通过影响白细胞与血管内皮细胞的粘附及跨内皮迁移，对组织细胞的保护使得患者免疫力低下；通过表皮和内皮细胞的选择渗透性屏障功能的影响使得肾虚患者更容易出现组织损伤和浮肿。在通过肾虚组与非肾虚组的miRNA表达谱对比研究发现，肾虚组与非肾虚组的差异主要涉及13条miRNA。这个13条差异miRNA，除部分miRNA的功能还不够清楚， hsa-miR-377, hsa-miR-497, hsa-miR-335等miRNA均主要影响机体的免疫功能和细胞凋亡。通过对这些差异miRNA进行靶基因预测，发现这些miRNA与机体免疫（如白介素家族，肿瘤坏死因子等）和细胞周期蛋白等有关，与前期全基因表达谱芯片结果吻合。在随后分别对筛选出来的目标基因和miRNA进行了qPCR验证，均与基因表达谱结果一致。此外,在对T2DM临床调查同时，针对对部分T2DM失眠患者进行中医松静功疗法，在于与药物治疗（谷维素）对照发现，中医心理松静功疗法在对睡眠质量、睡眠效率、抑郁、焦虑的改善均优于药物治疗。