miRNA ScFv靶向载体的构建及其抗肝纤维化的研究

microRNA（miRNA）是一类长约22nt的内源性非编码RNA，具有调节发育和内源基因表达的功能，是潜在治疗肝纤维化的基因武器。如何把miRNA定向导入目标细胞是应用miRNA治疗肝纤维化的关键问题。本课题采用具有细胞导向功能的单链抗体（ScFv）技术和RNA干扰技术，通过基因重组方法研制出抗αvβ3单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体的融合基因表达载体，然后经过转化、诱导表达、分离纯化和功能鉴定得到融合蛋白。利用鱼精蛋白带正电荷的特点，融合蛋白携带治疗基因let-7a表达载体分别导入体外HSC-T6细胞系以及肝纤维化大鼠体内，观察上述新型靶向载体携带let-7a表达载体的靶向性和抗肝纤维化效果。课题的成功，为肝纤维化基因治疗提供新型靶向载体，为提高治疗基因在靶组织浓度、降低剂量、减轻副作用和提高疗效提供实践基础，为肝纤维化多靶点、协同治疗提供理论基础。

肝星状细胞的激活是肝纤维化发生的中心环节，是细胞外基质的主要来源。以单链抗体为载体携带microRNA可实现靶向抗肝纤维化治疗。首先我们成功地构建了TGF-βⅡR单克隆抗体。然后从分泌TGF-βⅡR单抗的杂交瘤细胞株中，用RT-PCR扩增重链和轻链可变区基因，组装成单链抗体基因，并克隆至原核表达载体，以重组子转化大肠杆菌诱导目的基因表达。最后用基因重组技术构建抗TGF-βⅡR 单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合基因，经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达，表达的融合蛋白保持了与抗原的结合活性，同时具有结合dsRNA的能力。我们将融合蛋白携带miR-29b导入到肝星状细胞中进行了研究。跟脂质体相比，我们发现融合蛋白携带miR-29b具有更高的转染效率和更强的抗肝纤维化效果。此外，壳聚糖具有低毒性、良好的生物相容性、生物可降解性和来源广泛等特点，对此我们也进行了研究。我们发现纳米壳聚糖具有较高的转染效率，携带miR-29b具有较好的抗肝纤维化效果。我们顺利地完成了课题的原定计划。我们的研究成果创新之处在于成功地建立了携带miRNA靶向性导入肝星状细胞的非病毒工具，在肝纤维化方面具有独创性。另外这项工作具有很大的指引性，还可以建立导入肝癌细胞株的靶向性载体，对本领域起了示范作用。此外我们在原计划的基础上进行了合理的拓展和深入。随着miRNA研究的不断进展，我们尚进行了以下研究：①调控研究：miR-29b能降低PTEN甲基化水平进而提高其含量，从而达到抗肝纤维化目的；②机理研究：生物信息学分析miR-150的靶基因是Col4A4和Sp1，然后通过报告基因实验进一步证实了上述结果；③应用诊断研究：我们对miR-17-5p能否作为判断肝癌预后的非侵袭性指标进行了研究。结果发现高水平的miR-17-5p患者往往预后差，容易复发；④功能研究：转染miR-29b前体能抑制肝星状细胞的活性。总之，我们从多个角度对miRNA在肝纤维化的应用进行了系统研究，在SCI期刊共发表了4篇文章(最高IF=4.25)，在国内核心期刊发表了5篇文章。另外，《RNA干扰治疗肝纤维化的机制研究》还获得了浙江省高校科研成果奖三等奖（排名第1）。本人还申请了实用新型专利1项（已受理），这些工作为肝纤维化基因治疗奠定了坚实的基础。