肝纤维化相关微小RNA（miRNA）筛选、鉴定及其靶向调控功能研究

筛选与肝星状细胞（HSC）活化密切相关的微小RNA（miRNA）及其下游信号通路是肝纤维化发病机制研究的新领域，利用HSC靶向载体调节相关miRNA表达是肝纤维化转录后调控的新手段。前期工作发现，miR-21和miR-133在不同活化状态HSC中存在差异表达。本课题将进一步利用miRNA芯片鉴定人和动物纤维化肝脏中miR-21和miR-133差异表达情况；利用前期研究所构建的HSC靶向腺病毒，分别外源调控miR-21和miR-133在不同活化状态HSC中的表达水平，研究对肝纤维化进程和HSC活化的重要作用，并对其下游信号通路进行系统研究；将腺病毒经尾静脉单独或联合导入动物模型体内，研究上调miR-133表达和封闭miR-21表达对HSC 活化和肝纤维化进程的抑制作用；并进一步探讨miR-21和miR-133调控肝纤维化的分子机制，为肝纤维化基因治疗提供新的靶点和手段。

研究内容和研究目标按照申请书执行。首先利用miRNA芯片和实时PCR技术证实miR-21和miR-133差异表达与HSC活化及肝纤维化进程密切相关，同时还发现miR-155是调控HSC生物学活性的另一重要转录后调控因子。miR-21可通过沉默ERK/MAPK通路重要抑制剂SPRY2表达激活ERK/MAPK通路，导致HSC活化；并抑制肝细胞HNF4α表达，促进肝细胞发生上皮细胞间质转型（EMT），从而促进肝纤维化进程。外源下调活化HSC miR-21表达可显著抑制HSC增殖与生物学活性；下调TGFβ刺激后肝细胞miR-21表达后可促进HNF4α表达上调并显著抑制肝细胞EMT进程。体外上调活化HSC中miR-133表达，可抑制HSC增殖、活化及胶原合成等生物学活性。研究还发现，与肝纤维化相关的另一重要miRNA —miR-155可分别通过抑制EMT及ERK通路重要调控因子TCF4、AGTR1影响HSC生物学活性；外源上调活化HSC miR-155表达可抑制HSC增殖活化及胶原合成，其机制与抑制HSC EMT进程和阻断ERK通路有关。成功构建高效表达miR-21、miR-155、 miR-133及其 siRNA片段的腺病毒。利用腺病毒载体上调miR-155或下调miR-21在肝纤维化动物模型中的表达，初步研究表明，体内上调miR-155或下调miR-21表达可延缓实验性大鼠肝纤维化进程，相关体内研究结果目前仍在总结进行中。标注基金资助的1篇论著已发表于Hepatology，2篇论著已成文投稿国外SCI期刊，1篇综述发表于国内核心期刊，完成硕士学位论文1篇；体内部分结果有望在国外SCI期刊再发表论文1篇。课题开展过程中改进了miRNA、siRNA技术和腺病毒载体技术在肝纤维化基因治疗中的应用方法和工作程序，完善了消化内科实验室建设。培养4名硕士研究生。