以蛋白质芳香族氨基酸残基为共振能量转移体的均相亲和分析方法

经典荧光均相亲和分析技术用供体和接受体荧光团分别标记蛋白和配体，在形成复合物后供体与接受体的间距缩短而发生共振能量转移(FRET)，可测定FRET所致接受体荧光增强或供体荧光猝灭；但用荧光团标记蛋白成本高、效率低且可能影响蛋白功能。本项目提出以蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基为内源性FRET供体(不标记，不影响蛋白功能)而其特异小分子荧光配体为FRET探针和接受体，检测此探针与蛋白结合产生的FRET效应进行均相亲和分析，非竞争结合测定混合物中特定蛋白含量、竞争结合测定非荧光配体亲和力。据蛋白质酪氨酸和色氨酸残基荧光性质筛选所需FRET接受体荧光团，用于修饰其配体或替换其配体中的芳香环作为FRET探针；以链亲和素、人血清白蛋白、抗瘦肉精单抗、抗EGFR单抗、胰蛋白酶和磷酸二酯酶4为代表，考察此均相亲和分析技术测定非荧光配体亲和力及混合物中特定蛋白含量的可靠性，为建立此均相亲和分析新技术奠定基础。

本项目以蛋白质中色氨酸和酪氨酸残基为内源性FRET供体而其特异小分子荧光配体为FRET探针和接受体，检测此探针与蛋白结合产生的FRET效应进行均相亲和分析。主要完成如下工作。1. 据蛋白质色氨酸残基荧光性质筛选所需FRET接受体荧光团，发现1-萘胺和丹磺酰胺适合作为色氨酸残基的接受体荧光团。2. 基于此FRET效应，非竞争结合测定混合物中特定蛋白含量；成功用于测定人血清白蛋白含量、链亲和素含量。3. 基于此FRET效应，竞争结合测定非荧光配体亲和力：1）成功以链亲和素为靶蛋白测定非荧光生物素衍生物亲和力；2）成功用于GST 抑制剂表征；3）尝试表征磷酸二酯酶4抑制剂，但发现其灵敏度不足。4. 基于对蛋白色氨酸荧光的淬灭，1）成功测定抗青霉素单抗和青霉素亲和力；2）成功测定抗6His 标签单抗和亲和力。项目执行期间，合计发表标注NSFC资助论文超过21 篇；其中含海外专著中1章，作为通讯作者的SCI 收录论文17 篇，EI 收录论文1篇，CSCD 收录论文3 篇，及多篇未标记资助号论文。新申请中国发明专利 8 项、新申请PCT专利1项；获中国发明专利授权5项。在读博士研究生2名，在读硕士生 10 名。培养青年人才 2 名晋升副高和正高各1。培养毕业硕士生9名。