猪呼吸道上皮细胞抗病毒候选基因的分离与变异研究

呼吸道疾病是影响养猪业经济效益的重要因素之一，了解其发病的分子机制，采用遗传学方法从本质上提高猪对病原的抗性，开展抗病育种具有治本的效果。本研究根据呼吸道疾病的原发病原主要是病毒的特点，利用人工合成的双链RNA- - poly(I:C)模仿病毒刺激体外培养的猪呼吸道上皮细胞，采用基因芯片技术结合生物信息学、比较基因组学方法，筛选抗病功能未知且可能对呼吸道疾病有重要影响的基因作为候选基因；采用电子克隆、同源克隆及相应的分子生物学技术对序列未知的候选基因进行克隆、测序；采用真核表达技术研究候选基因的诱导表达机制；在候选基因的编码区和调控区寻找SNPs并采用定点突变和真核表达技术在细胞水平上研究变异的功能。为抗病基因SNPs功能研究提供新的思路，突破常规的相关性分析中群体和检测指标难以确定等条件的限制；为深入认识呼吸道疾病发生的分子机理及通过标记辅助选择手段促进抗病育种提供基础。

本研究利用病毒类似物poly(I:C)刺激体外培养的猪呼吸道上皮细胞，鉴定抗病毒候选基因并进行变异分析。开展的主要工作和获得的主要结果如下：（1）获得了poly(I:C)刺激下，猪呼吸道上皮细胞内显著差异表达（log2处理组/对照组>1，FDR<0.001）的基因449个，其中202个上调表达，247个下调表达；（2）在差异基因鉴定的基础上，首次克隆了猪PILRA/B、IFIT2/5、GPR84、MPEG1和sp100/110基因，并且PILRA/B各获得4个变异剪接体，sp100获得6个变异剪接体，sp110获得27个变异剪接体；（3）确定了猪PILRB基因的4个变异剪接体、IFIT2/5、GPR84和MPEG1基因普遍表达于所检测的各种组织内并且表达量存在着差异，他们的表达都能受到poly(I:C)影响并且呈现出时间和剂量依赖性；（4）利用双荧光素酶报告系统分析发现3’ UTR区的变异剪接影响着PILRB基因的转录表达；（5）分析了猪IFIT2基因的启动子活性，确定了IFIT2启动子的最小活性区，发现NF-κB结合位点和ISRE在IFIT2转录中有重要作用；（6）分析了IFIT2/5过表达对NF-κB和ISRE结合因子活化的影响，发现IFIT5抑制NF-κB的活化；（7）分析了猪PILRB、IFIT2/5和CMYA1基因的多态性，确定了不同等位基因在群体间的分布规律，并分析了IFIT2单体型变异对其功能的影响；（8）研究了sp100/110的亚细胞定位及变异剪接对亚细胞定位的影响；（9）检测了猪TLR3/4/5基因的多态性及不同等位基因在群体间的分布规律，在细胞水平上分析了TLR3基因的5个错义突变、TLR4基因的3个错义突变和TLR5基因的6个错义突变的功能，发现TLR3的c.933A>G（p.I311M）、TLR4的c.1027C>A（p.Q343K）、TLR5的c.1205C>T（p.P402L）和c.2239G>A（V747M）显著影响TLRs的配体识别和信号转导功能；（10）在群体水平上确定了TLR4的c.611T>A、c.962G>A、c.1027C>A和TLR5的c.834T>G、c.1065T>C、c.1205C>T、c.1246A>T、c.1269G>A、c.1398C>T与细胞因子表达和肺部损伤的关系，及变异对TLR4/5自身表达量的影响。