以蛋白激酶B为靶标开展苦参碱衍生物M19的构效关系和作用机制研究

Matrine, commonly used for treatment of acute and chronic hepatic disorders in clinic, has been found to possess variety of pharmacological effects such as anti-inflammation and anti-hepatic fibrosis. During our previous study, 13- amino-18-thio-matrine (M19) was identified as a lead compound, which showed more potent anti-inflammatory actvity in vitro and anti-hepatic fibrosis activity.in vivo than matrine itself. Meanwhile, protein kinase B (Akt) was dicovered as a specific intracellular binding protein of M19 by DARTS and Western blot. Further study proved that M19 had good inhibitory activty on Akt. All these results reveal that Akt is the potential binding target of M19. Akt is a serine/threonine protein kinase that plays a key role in multiple cellular processes such as cell proliferation, apoptosis and cell migration. Recent researches have shown that Akt is closely related to the formation and development of many diseases such as tummor and hepatic fibrosis. However, the structure and activity relationship(SAR) and mechanism of action (MOA) of M19 with Akt are still unknown. Based onmolecular docking study of M19 with Akt crystal structure, the project will focuson revealing the SAR and MOA with Akt of M19. This work will not only disclose the SAR and MOA of M19, but also provide new lead compounds for drug discovery of hepatic fibrosis and other Akt related diseases, so it has great significance and good application prospect.

苦参碱具有抗炎、抗肝纤维化等药理作用，临床上主要用于急慢性肝病的治疗。课题组前期通过对苦参碱开展结构改造发现13-甲氨基-18-硫代苦参碱(M19)体外抗炎活性和体内抗肝纤维化活性都明显优于苦参碱。随后，我们又采用DARTS和蛋白印迹等方法发现蛋白激酶B（Akt）为M19的特异性细胞内结合蛋白，进一步研究证实M19具有良好的Akt抑制活性，提示Akt为M19抗肝纤维化的潜在靶标。Akt在细胞增殖、细胞凋亡等生命过程中发挥重要作用并与肝纤维化等疾病的发生发展密切相关。但M19与Akt之间的构效关系及分子作用机制尚未阐明。本项目将以M19和Akt晶体结构的模拟结合方式为指导来开展其构效关系和作用机制研究，并同时开展M19和Akt的共结晶研究。研究结果不仅能阐明M19的构效关系和分子作用机制，还将为肝纤维化等Akt相关疾病提供新的先导化合物。因此，本项目具有重要理论意义和良好的应用前景。

苦参碱具有抗炎、抗肿瘤等药理作用，临床上主要用于急慢性炎症及其肝病的治疗。课题组前期通过对苦参碱开展结构改造发现13-甲氨基-18-硫代苦参碱(M19)体外抗炎活性。随后，我们又采用DARTS和蛋白印迹等方法发现蛋白激酶B（Akt）为M19的特异性细胞内结合蛋白，进一步研究证实M19具有良好的Akt抑制活性，提示Akt为M19抗肝纤维化的潜在靶标。Akt在细胞增殖、细胞凋亡等生命过程中发挥重要作用并与肝纤维化等疾病的发生发展密切相关。基于此，我们设计合成了13位氨基酸取代的M19，13位二硫代甲酸酯取代的M19，14位芳基取代的苦参碱，14位二硫代甲酸酯取代的苦参碱和14位硫醚取代苦参碱5个系列共计132的化合物，所有化合物均为新化合物，其结构由核磁共振与质谱鉴定。初步的药理学活性测试结果显示，13位氨基酸取代与13位二硫代甲酸酯取代的M19显示出比较强的体外抗炎活性，多个化合物活性优于先导化合物苦参碱与M19，其中以15B和15F两个化合物活性更强，基于此，我们开展了该类化合物的体内抗风湿性关节炎的活性及其机制研究，结果表明M19可以显着减轻了CIA小鼠的关节炎严重程度，同时能够改善关节肿胀和改善骨质侵蚀和破坏，作用机制研究表明M19可通过阻断MAPK的磷酸化和激活NF-κB的表达及诱导RA-FLS细胞凋亡作用。其它三个系列的苦参碱衍生物随虽也具有一定的抗炎活性，但其抑制细胞增殖的作用更为突出，因此我们展开了针对四种肝癌细胞Hep3B，HCCLM3, SMMC-7721, BEL-7404细胞的体外细胞毒实验研究，多个化合物显示出非常强的体外抗细胞增殖活性，其中以化合物6-22和8-11最佳，IC50达到15-30微摩尔，机制研究表明6-22可通过诱导细胞凋亡，将细胞周期阻断在G0/G1期，抑制PI3K / AKT信号通路，从而对肝癌细胞产生抑制作用。基于上述研究结果，发表研究论文4篇，申请国家发明专利2项，培养研究生2名。本项目的完成为进一步开发基于苦参碱的抗炎和抗肿瘤药物研究提供了一定的实验依据和理论基础。