miR-513a-5p靶向调控APE1介导骨肉瘤放疗敏感性的研究

APE1具有DNA损伤修复和氧化还原双功能，是骨肉瘤等多种肿瘤细胞放疗抵抗的关键基因。miRNA是基因表达调控的重要方式，晚近的研究陆续报道了调控p53、Ras等许多重要基因的miRNA，但靶向调控APE1的miRNA国内外尚未见研究。我们前期应用miRNA芯片、生物信息学以及Northern blot筛选出miR-513a-5p可能靶向调控APE1。本项目拟采用荧光素酶报告基因载体、Knock down、原位杂交、RNA干扰、APE1活性检测和EMSA等技术，进一步确证miR-513a-5p是APE1的靶向调节分子，并可通过下调APE1增强骨肉瘤放疗敏感性。该研究不仅首次确证调控APE1的特异miRNA，拓展miR-513a-5p的新功能，而且也为解决骨肉瘤的放疗增敏提供一个新的思路更有效的靶点。

脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(APE1)具有DNA损伤修复和氧化还原双功能，在骨肉瘤放疗抵抗中发挥核心调节作用，敲低APE1能显著增强骨肉瘤放疗敏感性。然而其介导骨肉瘤放疗敏感性的机制不清。新近的研究表明，miRNAs可通过抑制靶基因相关的信号转导通路的活化，增加细胞凋亡或调节细胞周期，进而降低肿瘤辐抵抗，为研究和发现APE1基因调控通路和相互作用蛋白，阐明APE1介导的骨肉瘤放疗敏感性的机制提供了新的研究方向。本课题利用APE1敲低的骨肉瘤细胞株模型、miRNA芯片、QRT-PCR以及生物信息学确证了：APE1可直接影响骨肉瘤HOS细胞株miRNAs的表达谱，通过上调或下调miRNAs影响下游靶基因的表达，参与TGF-β、Wnt、MAPK和p53等重要的细胞信号通路以及骨肉瘤的发生发展。其次，发现了APE1与miRNAs可互相调节：一方面，敲低APE1后miRNAs可上调或下调，其中通过生物信息学实验，初步探讨了下调的机制可能是：APE1表达降低可减少AP-1、NF-κB、p53、HIF-1α等转录因子活性，继而抑制miRNAs的转录；另一方面，发现miRNA可靶向抑制APE1的表达：通过细胞水平研究和构建miR-513a-5p过表达骨肉瘤裸鼠模型，同时在体内和体外实验中确证了芯片中上调的miR-513a-5p能够与APE1 mRNA 3’UTR区的CAACCA位点靶向结合，抑制APE1蛋白表达，并通过抑制APE1的DNA损伤修复功能和氧化还原功能，抑制Bcl-2的抗凋亡通路，增加细胞凋亡，抑制细胞增殖，最终提高骨肉瘤细胞放疗敏感性。本课题已按计划完成全部研究内容，已发表SCI论著2篇，培养博士2名（其中1名已毕业，1名在读），另有1篇SCI和2篇中文论著待发。