以APE1为核心的microRNAs调控介导骨肉瘤化疗抵抗分子机制研究

APE1具有DNA损伤修复和氧化还原双功能，是骨肉瘤等多种肿瘤化疗不敏感的关键基因。miRNA具有调控基因表达的特点，新近陆续报道了p53、Ras等许多重要基因的上下游miRNAs，然与APE1相互作用的miRNAs国内外尚未见报道。我们前期检测骨肉瘤细胞APE1基因敲除前后的miRNA表达谱，借助生物信息学和预实验发现"miR-765上调-APE1下调-miR197下调"具有合理的上下调控逻辑，可能是APE1调控的新方式。本项目拟采用荧光素酶报告基因载体、原位杂交、RIP-ChIP、APE1活性检测和EMSA等技术，确证miR-765靶向调控APE1，APE1调节miR197的通路活性，阐明"miRNAs-APE1-miRNAs"介导骨肉瘤化疗抵抗的作用机理。本项目不仅有助于丰富APE1上下游的多元化调控方式，更有利于拓展miRNAs的新靶点新功能，为骨肉瘤临床化疗增敏提供新的思路。

骨肉瘤是多发于青少年的对化疗中度敏感的高度恶性肿瘤。肿瘤细胞化疗耐药性的产生是化疗失败的主要原因。APE1具有DNA损伤修复和氧化还原双功能，是骨肉瘤化疗不敏感的关键基因。通过对APE1调控的改变可作为骨肉瘤细胞化疗增敏的有效手段。本项目提出miR-765-APE1/ APE1-miR-9的轴向调控方式，其中并以APE1为核心在骨肉瘤的化疗抵抗中发挥作用，增强了骨肉瘤顺铂治疗敏感性。研究发现miR-765与APE1的表达存在负相关，miR-765能够靶向结合APE1，并调节APE1基因的DNA损伤修复功能和氧化还原功能，从而抑制APE1的双功能活性。体内及体外实验均证明miR-765通过抑制APE1增强骨肉瘤细胞顺铂治疗的敏感性。在临床样本中，生存分析结果显示高表达miR-765的骨肉瘤患者的预后显著优于miR-765低表达患者，而APE1与预后的关系则表现为相反的趋势，miR-765可作为保护因素影响骨肉瘤患者的预后。同时我们发现miRNA-765靶向敲低APE1后，其TGFβ蛋白水平、微血管密度均下降，降低了骨肉瘤细胞的血管形成能力，抑制骨肉瘤生长。移植物成瘤实验与组织芯片结果显示，miR-197与APE1的表达的相关性不显著。我们重新筛选出miR-9为APE1调控的下游miRNA，发现miR-9与APE1、miR-765表达均有相关性。miR-9与APE1表达呈正相关，与miR-765表达呈正相关，且miR-765与miR-9之间通过APE1作为桥梁相互调控。而且发现APE1表达受抑制后其氧化还原活性减弱，促使转录因子NF-κB对miRNA启动子的DNA结合活性降低，引起miR-9表达降低。miR-9的下调能够增强骨肉瘤细胞对顺铂治疗的敏感性。从而证实了以APE1为核心的miR-765↑—APE1↓—miR-9↓的轴向调控方式。miR-765↑—APE1↓—miR-9↓调控通路的确证不仅在理论上拓展和丰富了APE1功能特点，亦有助于阐明miRNAs调控机制在肿瘤细胞化疗抵抗中的重要作用，提高了骨肉瘤化疗敏感性。