庆大霉素抵抗耐药结构——3’,4’双脱氧生物合成基因的鉴定及功能研究

Drug resistant pathogens have spread dramatically over the world, which have become a major threat to public health. New semi-synthetic aminoglycoside antibiotics generally use chemical modification to avoid inactivity from pathogens, one of the most used modification is 3’,4’di-deoxygenation, which imitate structure of gentamicin. Although genB3, genP, genB4 were found having relationship with gentamicin deoxygenation, because of the unique structure and biosynthetic genes of gentamicin, and the di-deoxygenation was catalyzed by enzyme complex, the genes for di-deoxygenation have not identified entirely and the enzyme function have not studied also, which impede application of the di-deoxygenation in create new drug by biosynthetic methods. This study will preliminary analysis of di-deoxygenation genes by gene disruption, then all di-deoxygenation involving genes will be expressed heterologously in vivo as a gene set and in vitro for enzyme study individually. Combined results of the three different methods, we will clarify genes and the unique biosynthetic pathway of gentamicin di-deoxygenation, deoxygenation enzyme complex will also be utilized for constructing strain producing semi-synthetic dibekacin at the same time. This work will lay the foundation for utilizing di-deoxygenation enzyme complex for biosynthesis semi-synthetic antibiotics like dibekacin or create new drugs with better bioactivity.

耐药性致病菌在全球范围内迅速增多，已成为人类健康的重要威胁。新的半合成氨基糖苷类抗生素通过结构修饰以对抗耐药菌，最常用的方式之一为3’,4’双脱氧。这一修饰方式借鉴于庆大霉素等含有双脱氧结构的抗生素。虽然已有实验证明genB3、genP、genB4与庆大霉素双脱氧过程有关，但由于庆大霉素化学结构及其合成基因的独特性，且双脱氧由多个酶共同催化，目前参与庆大霉素双脱氧过程的酶及其编码基因未全部确定，酶的功能未阐明，脱氧途径不清楚，阻碍了双脱氧结构在生物合成药物中的应用。本课题通过对推测参与双脱氧的基因进行阻断初步确定基因功能，通过多基因在链霉菌中共表达、体内催化，酶在大肠杆菌表达、体外催化等不同方法相结合，明确参与庆大霉素双脱氧的基因及其功能、阐明双脱氧生物合成途径，同时获得利用双脱氧酶系发酵产生半合成抗生素地贝卡星的菌株。为利用生物法直接生产半合成抗生素和产生新的、更优活性的抗生素打下基础。

氨基糖苷类抗生素是临床应用多年的抗生素，但这些抗生素的生物合成途径目前还没有彻底阐明。阐明这些抗生素生物合成途径，不仅能够丰富对生物合成途径和机制的认识，而且能够改造合成途径产生新的抗生素或者提高目标产物的产量。.本研究在庆大霉素通过基因阻断实验，证明genP、genB3、genB4参与庆大霉素双脱氧过程。其中GenP催化底物的磷酸化，通过磷酸化活化羟基，形成易离去基团。基因genB3阻断后，阻断菌株不再产生双脱氧产物，体外实验初步证明其负责脱磷酸化。而genB4阻断后则形成系列C-4’,5’双键产物，证明GenB4催化双脱氧反应中最后一步：双键还原为单键。证实了庆大霉素双脱氧过程的参与基因，明晰了双脱氧生物合成过程。.庆大霉素生物合成是以UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-木糖作为前体，经过糖苷转移酶催化以及其他修饰酶的催化作用下形成不同的庆大霉素组分。在过表达KanM1、 GenM2的情况下，庆大霉素B产量从出发菌株的产量822±52μg/ml提高至1132±68μg/ml。在补加1%葡萄糖的条件下，产量提高54%。在庆大霉素C1a采用相同的方式效价提高了45％。表明过表达糖苷转移酶将初级代谢物转化为次级代谢物有助于提高庆大霉素的产量。由于糖苷转移是氨基糖苷类抗生素合成的共有合成途径，因此推测在其他氨基糖苷类抗生素中过表达相应的糖苷转移酶也是一种行之有效的策略。相关实验结果已以第一标注发表SCI文章。.2-DOS类抗生素中，除了庆大霉素B和卡那霉素A的C2'为羟基外，其余C2'都为氨基。为了研究C2'羟基形成机制，在卡那霉素链霉菌中阻断了C2'因kanJ，阻断株的大量堆积卡那霉素B，而不再合成卡那霉素A，证明了卡那霉素B是卡那霉素A合成的前体，KanJ参与催化这个脱氨基转羟基反应。得到了高产卡那霉素B的工程菌，产量为3268 μg/mL，是出发菌株产量的13倍。考察了不同插入方式和拷贝数增加了kanJ和kanK的表达，与原始菌株相比卡那霉素B产量下降54%，提高了发酵液中卡那霉素A纯度，降低了分离纯化成本。相关研究已以第一标注发表SCI论文一篇。申请发明专利一项。.以第一标注发表SCI论文两篇。