喜树碱的生物合成研究

喜树碱及其衍生物是临床用于多种恶性肿瘤治疗的萜类吲哚生物碱。由于其化学合成路线长、总收率低等原因，目前喜树碱还依赖于从植物中分离、制备，但喜树碱在植物中的含量太低，分离困难大，且植物生长周期长，次级代谢产物积累进程缓慢。利用生物技术改造从而提高喜树碱产量也由于其生物合成途径不清楚而进展不大。我们发现了产喜树碱的内生真菌，从中克隆到了所有萜类吲哚生物碱生物合成的关键基因str样基因。本项目拟从产喜树碱真菌中克隆喜树碱的生物合成基因，进行序列测定、功能分析，解析喜树碱生物合成途径，进行喜树碱生物合成过程中的关键酶的异源表达、生化表征、酶促反应机理研究，阐明喜树碱生物合成过程中酰胺化、吲哚环开环及喹啉环的成环机制、多步骤氧化-还原反应、脱糖基化、羟化等反应的机理与时间，以及生物合成中的立体化学问题；为化学、酶法或化学-酶法偶联进行喜树碱及其"非天然"天然产物的合成和代谢工程重建奠定基础。

临床广泛使用的喜树碱类药物以喜树碱为原料经化学衍生得到。因为化学合成路线长、总收率低，喜树碱还依赖于从植物中提取、分离、制备，但喜树碱在植物中的含量太低，分离难度大。利用生物技术改造、提高喜树碱产量是研究热点。因而，全面了解喜树碱的生物合成过程十分重要。.在自然科学基金资助下，我们对喜树碱生物合成过程进行研究，取得如下结果。从喜树中得到600余株内生菌，经过发酵、筛选，我们发现产喜树碱真菌4株、细菌2株。后续研究表明，其中4株菌在第二代即丧失产喜树碱能力，仅有内生真菌、细菌各1株至第八代仍能产喜树碱，且相对稳定，虽然它们在第二代也发生了喜树碱产量的急剧下降。对退化的产喜树碱Aspergillus sp. LY013的代谢产物研究表明，在获得的9个复杂生物碱中7个为吲哚类生物碱。.1-8代均能产喜树碱的内生菌LY214被鉴定为Paenibacillus polymyxa LY214，LY357为Trichoderma atroviride LY357。后续发酵（包括培养基、时间、pH、温度、摇床转速、诱导子添加、生物合成前体添加、吸附树脂添加等）优化表明，LY214在其最优条件下喜树碱产量可提高15~30倍，最高产量为23 g/L，而LY357在其最优条件下喜树碱产量可提高50~75倍，最高产量达142 g/L。对LY214和LY357基因组的测序、基因功能注释结果表明，上述两株菌中均存在喜树碱生物合成的萜类和吲哚类途径，但催化萜类和色胺进行Pictet-Spengler缩合的关键酶及后续催化步骤的酶类难以确证，我们推测产喜树碱内生菌和喜树间存在基因水平转移事件。.基于上述研究结果，我们培养喜树幼苗等，基于同源克隆、RACE、OEPCR等技术原理，已经克隆到了喜树碱生物合成过程中的CamCPR, CaGES等10余个基因。利用生物信息学软件进行基因功能分析、比对、三维结构预测等，将它们分别引入E. coli中进行表达、纯化得到纯酶或在总酶水平，通过添加合适的底物，对CamCPR, CaGES, CaC4H2, CaLAMT, CaG10H, CaTDC, CaSLS, CaSTR等基因的功能进行了详细的体内外生化功能表征，确证了它们在喜树碱生物合成中的功能。.上述研究结果已经发表论文8篇，2篇正在审稿中，SCI收录共6篇，申请并获授权相关专利2项，培养研究生3名。