基于进化和重测序研究艾美耳球虫早熟虫株裂殖生殖代次减少的分子机制

Previous studies showed that successively selecting and propagating the earliest secreted oocysts of eimerian parasites could result in the development of precocious lines, in which one or more generations of schizogony were deleted. As those precocious lines were proved to be genetically stable, we plan to decipher the mechanisms controlling the generations of schizogony in Eimeria with the strategy of evolve and resequence (E&R). We will conduct sequencing and resequencing of parental lines and precocious lines of Eimeria, sequence the transcriptomes of different stages of these lines, analyze the single nucleotide polymorphism (SNP) within the differentially expressed genes between genomes and search for candidate genes, and finally validate those candidates by knock-out, mutation and overexpression in parasites. This project will decipher the mechanisms that controlling the deletion of the shcozogony generations in Eimeria and thus be valuable for coccidiosis control in Eimeria-infected birds and livestocks. With the support of this project, 3-5 graduate students will be trained and 3-5 articles will be published in international journals.

前人研究表明，在收集最早排出体外的球虫卵囊并连续传代的选择压力下，多种艾美耳球虫的裂殖代次可减少1代甚至多代且保持遗传稳定，成为所谓的早熟虫株（实验性进化）。有鉴于减少裂殖代次的艾美耳球虫可以保持遗传稳定，同时借鉴其他近缘虫种已发现无性生殖和有性生殖受突变基因的研究成果，我们拟基于进化和重测序（Evolve and resequence）策略寻找与裂殖代次减少表型直接相关的基因及其调控机制。本研究将获得不同的艾美耳球虫早熟虫株，对原始虫株和早熟虫株进行基因组测序及重测序、不同阶段虫体的转录组测序，通过分析不同虫株间差异表达基因的SNP来寻找裂殖代次调控的候选基因，并以转基因敲除、突变或过表达的方式来进行功能验证，最终解析艾美耳球虫早熟虫株裂殖代次减少的分子机制。本研究将培养研究生3-5名，发表国际论文3-5篇。

艾美耳球虫在连续人工定向选育的压力下，能够获裂殖代次减少一代甚至多代的早熟虫株。与野生虫株相比，该早熟虫株除了具有内生性发育加快的特征外，还具有潜隐期提前、毒力减弱和排卵囊量下降等特征。基于这些特征早熟虫株能够被制作成早熟致弱活疫苗，对球虫病进行防控。到目前为止，球虫早熟虫株产生的分子机制仍未解析。首先，本研究采用PacBio三代测序并结合Hi-C技术对柔嫩艾美耳球虫参考基因组进行从头拼接组装和注释，构建了染色体级别的柔嫩艾美耳球虫基因组。其次，本研究将CRISPR-Cas9系统引入柔嫩艾美耳球虫，构建了一株能够稳定表达Cas9蛋白的柔嫩艾美耳球虫虫株，实现了对球虫基因组的定点编辑。同时，本研究主要通过实验进化和重测序、群体选择性清除和连锁群选育法等遗传学定位手段，以及DNA甲基化、microRNA以及组蛋白修饰等表观遗传学筛查两个方面对艾美耳球虫早熟分子机制进行研究。我们通过实验进化体系，发现经早熟定向选育后的虫株与其亲本之间在第8号染色体上20 kb区域有强烈的选择信号，并初步得到MEM基因为参与球虫早熟发育的候选基因；同时，利用连锁群选育法也能在该基因区域找到相应的选择信号；而通过对从田间采集分离得到的早熟群体和野生群体进行群体遗传学分析，发现SAG基因家族一些蛋白可能与早熟性状相关。转录组比较发现3个与识别H3K9me3修饰相关的chromodomain蛋白在早熟虫株中显著上调表达；而该基因自身的表达则受到组蛋白H3K9me3、H3K9ac和H3K4me3修饰的调控，强烈提示 chromodomain蛋白的表观修饰可能调控球虫早熟表型（亦即裂殖生殖发育代次减少）。发表研究相关的SCI论文7篇,培养毕业博士研究生3名，硕士研究生1名。该研究为进一步解析其分子机制提供技术和基础理论支持