NKX2-5调控miRNA主导VEGF/NFATc1信号通路在先心病发生中的分子作用机理研究

Congenital heart disease (CHD) is one of the public health problems which seriously affects the quality of Chinese population. The development mechanism of CHD has not been completely elucidated yet. Our previous study found that dysfunction of NkX2-5 may be the key cause of CHD. The result of analysis indicated that the expression of miR-1 is negatively regulated by NKX2-5. In addition, multi-databases calculation shown that VEGF was the target of a group of miRNA which is representative of miR-1. Therefore, NKX2-5 may play an important role in the differentiation of endocardial cells to atrioventricular septum through activating the VEGF/NFATc1 pathway by miR-1. Our study planned to perform transcriptome and miRNAome analysis to atrial septal defect cases and control tissue by deep sequence and advanced bioinformatic analysis. Through qRT-PCR, Western blot and ect, we investigated the relationship among NKX2-5、miRNA、VEGF/NFATc1. Comprehensively, we studied the differentiation mechanism of endocardial cells to atrioventricular septum promoted by NKX2-5 and VEGF/NFATc1. Finally we evaluated the function of these tree key points to cardiac development in vivo, hoping to illustrate the molecular development mechanism of atrioventricular septum mediated by NKX2-5. Importantly, we will explore the possibility of establishing the animal model of atrial septal defect by genome editing strategy. Our study will provide a new target to CHD prevention and treatment.

先心病严重影响我国新生人口素质，但形成机理尚未完全阐明。前期工作发现NKX2-5基因功能缺失可能是导致先心病的关键，而miR-1表达受NKX2-5的负调控。多数据库推算表明VEGF是以miR-1为代表的小RNA靶基因。因而NKX2-5可能通过调控miR-1激活VEGF/NFATc1通路参与心内膜细胞向房室间隔的分化。本研究拟采用RNA-seq对房缺病例组织和对照组织转录组和miRNA进行深度测序和高级生物信息学分析。利用qRT-PCR和免疫印迹等方法在NKX2-5、miRNA、VEGF/NFATc1三个层次探讨三者的关系，并全面研究NKX2-5促进VEGF/NFATc1诱导心内膜细胞向房室间隔分化（EMT）的过程，最后在动物上评估三个关键环节对心脏发育的调控，以期阐明NKX2-5参与房间隔发育的分子机制。并探讨通过基因修饰技术建立先心病房缺动物模型的可能性。本研究将为先心病防治提供新靶点。

先天性心脏病严重影响我国新生人口素质，但其形成机理尚未完全阐明。在我们的前期工作中发现NKX2-5基因功能异常可能是导致先心病发生的关键因素。多数据库推算表明VEGF是以miR-1为代表的小RNA的靶基因，而miR-1的表达受NKX2-5的负调控。因而NKX2-5可能通过调控miR-1激活VEGF/NFATc1通路而参与心内膜细胞向房室间隔的分化。本研究拟采用RNA-seq技术对房间隔缺损病例组织和健康对照组织的转录组和miRNA进行深度测序和高级生物信息学分析。利用qRT-PCR和免疫印迹等方法在NKX2-5、miRNA、VEGF/NFATc1三个层次探索三者的关系，并全面研究NKX2-5促进VEGF/NFATc1诱导心内膜细胞向房室间隔分化（EMT）的过程，最后在动物模型上探索NKX2-5对心脏发育的调控，以期阐明NKX2-5参与房间隔发育的分子机制，并探讨通过基因修饰技术建立先心病房缺动物模型的可能性。本研究通过流行病学调查，得到了云南省先天性心脏病的发病率数据和病理类型资料，为先天性心脏病的预防和治疗提供了详实可信的临床数据并建立了云南省先天性心脏病的临床研究样本库，为后续研究的开展提供了基础。通过收集临床患者样本，提取DNA进行深度测序，于房间隔缺损患者中发现NKX2-5基因突变位点，共发现 SNP 18 个，新的突变位点 12 个，其中SNPs rs2277923和rs3729753具有较高的风险值。利用荧光素酶报告系统实验发现, NKX2-5 能与 miRNA1-1 的前导序列结合，不能与 miRNA1-2 的前导序列结合。NKX2-5抑制 miRNA1-1 表达，不能抑制 miRNA1-2 表达。利用RNA干扰技术，成功诱导出小鼠先天性心脏病模型。通过敲低孕期小鼠的NKX2-5，可以导致小鼠心脏出现人类先天性心脏病的组织学改变，这些结果进一步验证和明确了NKX2-5对心脏发育的核心调控作用。利用取自法洛氏四联症患者的皮肤成纤维细胞，成功诱导出诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC，再对IPS细胞进行心肌细胞方向的诱导分化，诱导出具有自主收缩功能的心肌细胞。同时构建了携带TBX1突变的IPS细胞，为进一步研究TBX1基因突变提供了模型细胞。