缺氧诱导因子-α的调控对大鼠动静脉袢模型血管化进程的影响

The cells planted in the three-dimension frame in the in vivo tissue Engineering studies rely on sufficient perfusion from capillary network. How to vascularize the frame quickly and efficiently is the key of successful tissue construction. The Arterovenous Loop (AV Loop) model is a vascularization model in rats. The loop is composed by interposing a femoral vein graft into the distal ends of the contralateral femoral artery and vein, which is capable of generating a three dimensional unit with cells as well as the supporting vessels within a container. In our previous study the loop sealed in the container was discovered to undergo hypoxia, characterized by Hypoxia Inducible Factor (HIF)- α up-regulation. The vascularization followed the increasing of HIF-α temporally, while spatially it was positively correlated with the HIF-α level. Further by utilizing DMOG(Dimethyloxallyl Glycine), a HIF-α hydroxylase inhibitor, systemically and constantly in a small dosage, the vascularization process can be promoted. Aiming towards regulating the vascularization process in the rat AV Loop model by HIF-α modulation, the HIF-α modulating drugs systemically in the animals, to up- or down-regulate HIF-α to promote or to suppress the vascularization correspondingly. Thus, the process of the vessel outgrowth could be controlled in the AV Loop model, which would be helpful to develop its application in the in vivo tissue engineering, and even in some other studies such as in vivo cell culture and tumor angiogenesis.

体内组织工程研究的关键之一是使三维支架迅速有效血管化。大鼠动静脉袢（Arteriovenous Loop）模型，是取大鼠一段股静脉显微吻合于对侧股动静脉远端形成的血管袢，将其包埋入立体支架，可诱导形成带血管网的立体组织。我们的前期研究发现动静脉袢周边局部缺氧致使缺氧诱导因子（HIF）-α增加，继而血管化进程启动，且新生血管空间分布与HIF-α密切正相关。此外HIF-α水解酶抑制剂DMOG（Dimethyloxallyl Glycine）全身持续小剂量应用于动物模型载体可以增加AV loop中新生血管的数量。本研究拟进一步对实验动物使用HIF-α的调控药物，期望通过上调HIF-α促使血管化，下调HIF-α抑制血管化，从而通过调节HIF-α实现对该模型的血管化进程的调控。促进该模型在体内组织工程研究中的发展，及体内细胞培养、肿瘤血管生成等扩展研究。

研究背景：组织工程旨在通过生物工程技术构建替代组织或器官，从而修复疾病和创伤引起的组织、器官的缺损或功能障碍。组织工程研究的关键之一是使三维支架迅速有效血管化，前期研究证实一型缺氧诱导因子（HIF-1）可以通过调控其下游成血管相关因子的表达来促进组织工程血管化进程。氯化钴，去铁胺，DMOG等传统的HIF-1稳定剂存在较为显著的毒性或者脱靶效应。一种新型的HIF-1稳定剂FG-4592可通过选择性抑制HIF PHD 的羟化作用来抑制HIF-1α亚基的降解，从而发挥稳定HIF-1的作用。本研究拟在体内外组织工程模型中验证FG-4592的成血管作用。.研究内容: 首先在体外利用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的划痕实验和成管实验来验证FG-4592的促成管能力，并利用qPCR和Western Blot来验证FG-4592对HIF-1a和VEGF1在转录和蛋白水平的影响。随后，在大鼠背部皮下构建组织工程室模型，通过纤维蛋白凝胶（Fibrin）作为载药体系向组织工程室中导入FG-4592，于不同时间点（3，7，14天）通过组织学切片观察其大体形态，新生血管形态以及HIF-1a和VEGF1的表达情况。.研究结果及关键数据：细胞实验结果：和空白对照组相比，50uM浓度的FG-4592可以提高HUVECs的细胞迁移能力，而20uM浓度的FG-4592可以提高HUVECs的成管能力。20uM FG-4592处理后HUVECs细胞的HIF-1α和VEGF蛋白表达显著提升，在转录水平，20uM FG-4592处理后VEGF表达量显著提高，而HIF-1α表达量降低。动物实验结果：在大鼠皮下组织工程室模型中，载有FG-4592的Fibrin能够显著提高新生纤维血管组织厚度，增大血管截面面积，对巨噬细胞浸润向新生组织的进入不产生影响。此外在FG-4592作用下，新生纤维血管组织中的HIF-1α和VEGF阳性表达细胞量均显著提高，而Ki67阳性表达细胞量减小。上述结果表明，FG-4592能够在体外模型中促进内皮细胞的成管，并在动物模型中促进血管的新生和成熟，FG-4592的成血管作用是由PHD-HIF1α-VEGF信号轴来介导的。.科学意义：本研究从多角度证实了FG-4592这一新型的HIF-1稳定剂能够通过影响缺氧相关信号通路促进血管新生和成熟，为今后组织工程血管化的实施提供了新的工具。