胰腺癌中乙肝病毒整合及整合靶基因MLL4的插入诱变机制研究

Pancreatic cancer is one of the most severe forms of malignancy with poor prognosis. Its etiology is largely unknown. Recently, epidemiology studies have suggested that serum markers of hepatitis B virus （HBV） are significantly associated with pancreatic cancer. However, the mechanism underling this association remains investigation. In our previous work, we have provided evidence that HBV can infect pancreatic tissue and replicate in the pancreatic cells. Recently, we have identified the HBV DNA sequences from the genome of pancreatic cancer cell. Viral integration is one of the important mechanisms by which oncoviruses use to induce cell malignant transformation. In this study, we aim to characterize the HBV integration sites in the genomes of pancreatic cancer and the paired non-cancerous pancreatic cells by using the next generation sequencing technique, and to explore the biological impacts of HBV integration on host cells. Meanwhile, we will conduct a series of in vitro and in vivo studies, including using DNA-edited cell lines and site-specific knock-in mice, to understand the role of MLL4 (myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 4), a recurrent target gene for HBV integration, in the development of pancreatic cancer. The results of this project may provide a new strategy for the prevention and intervention of pancreatic cancer.

胰腺导管腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤，在我国发病呈上升趋势，但其确切病因尚不明确。近年，流行病学研究发现胰腺癌与乙型肝炎病毒（HBV）血清标志物显著相关，但对HBV感染如何引起胰腺癌发生的分子机制尚未见深入研究。在以往工作中，我们报道了HBV能感染胰腺组织，并在胰腺细胞中进行复制。新近，我们又发现胰腺癌细胞染色体上存在着HBV整合现象。整合是肿瘤相关病毒致癌的重要机制之一，为此本项目拟应用“HBV捕获深度测序”等新技术，系统研究HBV在胰腺癌中的整合规律及生物学意义，确定HBV是否为胰腺癌发生的一个新的分子病因。同时，对胰腺癌中被HBV重复整合的“混合谱系白血病基因4”（MLL4），我们将通过细胞“基因编辑”和小鼠“基因敲入”等一系列体内外研究方法，探索HBV“插入诱变”在胰腺癌发生发展中的作用和机制。本项目研究结果，将有助于为我国胰腺癌的防治提供新的策略和靶点。

流行病学研究提示胰腺癌（PDAC）与乙肝病毒（HBV）感染有关，但对其分子机制尚未见报道。本项目从病毒整合入手，探索了HBV导致PDAC发生的机制。结果包括：1. 应用HBV捕获结合二代测序的方法,在PDAC和癌旁组织中鉴定了425个HBV整合位点。整合主要发生于基因间区（51.29％）、内含子（43.29％）和外显子（2.35%）。有7个蛋白编码基因和两个非编码基因的外显子受HBV整合。并有9个蛋白质编码基因和4个非编码基因在不同样本中被HBV 重复整合。整合在第16号染色体和HBV S基因中的发生率最高。 2. 对HBV整合基因进行了功能注释，GO分析提示它们与细胞分化、粘附、迁移等相关,KEGG分析它们富集于Ras等信号传导通路。GEO和TCGA数据库分析显示4个在癌组织中分离获得的整合基因中，3个在PDAC有高表达,而癌旁分离获得的3个被整合基因,未见有差异表达。9个受HBV重复整合的蛋白编码基因中，7个在癌和癌旁具有差异表达，其中 PLCB1和HELQ的表达水平还与PDAC生存相关。3. 通过比较PDAC和肝癌（HCC）中HBV整合位点，发现了MLL4等23个基因在两个癌种中均被HBV整合，提示了这些基因在不同肿瘤中均有作用。4.对PDAC和HCC中均受HBV整合的MLL4基因进行了功能研究，结果表明MLL4在PDAC中的表达显著上调。体内外实验证实MLL4具有增强PDAC细胞恶性行为、促裸鼠皮下瘤和原位癌生长、转移的功能。5. 对MLL4过表达的PDAC细胞进行了RNA-seq及CHIP-seq检测，交集分析发现53个共同改变的基因,其中12个富集于癌症信号通路上。数据库分析显示10个在PDAC中有表达量的显著改变。 6. 对受MLL4调控的FYN和SMAD9基因进行了进一步研究,提出了MLL4通过FYN-SMAD9-PI3K/AKT-MMP1/CCND1轴发挥促PDAC生长转移的假说。6. 通过基因打靶技术，获得了在PDAC中高表达MLL4的条件性基因敲入小鼠。7. 发现了在HCC中,MLL4同样可以通过PI3K/AKT通路促HCC生长。总之，本研究首次揭示了HBV在PDAC细胞中的整合和整合规律，并从受整合基因的功能分析入手，证实了MLL4为一促PDAC生长基因。本研究结果为PDAC的病因学防控提供了新的方向,也为PDAC的发病机制研究提供了新的线索