AMPK对内源性H2S的调控及fraxinellone治疗炎性肠病的机制研究

It has been shown in preliminary studies that CBS (cystathionine-β-synthase)- H2S signal was down-regulated with the progress of ulcerative colitis. And fraxinellone, a small molecule from TCM Dictamni, demonstrated significant effects on the inflammatory bowel disease through reversing the decline of H2S in the local colonic tissue. We found for the first time that AMPK (adenosine mono-phosphate-activated protein kinase), a target protein of fraxinellone, might be the upstream regulatory factor of H2S synthase - CBS. In this project we intend (1) to investigate the distribution and variation of AMPK-CBS-H2S signal both in colon tissue and in the in vitro culture system of colonic epithelial cell - T cell, (2) to measure the intermolecular interactions between AMPK and CBS by the calculation of three-dimensional structure of the molecules and the binding assays of the proteins as well as their single / multi-sites mutations, and (3) to examine the effects of fraxinellone on AMPK-CBS interaction and variation in the process inflammatory bowel disease. Finally, several models of inflammatory bowel disease will be set up to study the downstream pathway and effects of endogenous H2S upregulation by fraxinellone.

前期研究表明，肠组织中的CBS(胱硫醚-β-合酶，cystathionine-β-synthase)-H2S信号随溃疡性结肠炎的进展而下调，小分子化合物fraxinellone能逆转这一过程并展现出良好的治疗效应。以fraxinellone为探针，首次发现其结合蛋白AMPK（磷酸腺苷激活的蛋白激酶）可能是H2S分子合成酶CBS的上游调控因子。本项目拟进一步考察AMPK-CBS-H2S信号在结肠炎组织局部各细胞及体外培养的肠上皮细胞-T细胞体系中的分布及其变化情况。通过对AMPK与CBS分子的三维立体结构的计算和单/多位点突变后AMPK与CBS的结合试验考察分子间相互作用。阐明fraxinellone如何影响AMPK-CBS分子间信号传递及炎性肠病过程中的分子变化。构建多个炎性肠病模型，着重考察给予fraxinellone上调内源性H2S的下游效应及其对疾病治疗的作用和意义。

在前期研究中，我们提出科学假说，小分子化合物fraxinellone对炎性肠病的治疗效应可能是通过AMPK（磷酸腺苷激活的蛋白激酶）分子影响肠组织中的CBS(胱硫醚-β-合酶，cystathionine-β-synthase)-H2S 信号。本课题研究中我们首先构建了DSS诱导的急性和慢性肠炎模型，阐明AMPK及其下游分子在肠炎发生发展过程中的变化及其调控作用。我们发现，AMPK的磷酸化水平在肠炎发生发展的过程下调，而AMPK激活对DSS诱导的小鼠结肠炎具有改善作用。这种作用是两方面的，一方面对肠组织浸润炎症细胞及其NF-kappaB和NLRP3通路有抑制，另一方面更重要的是能对结肠上皮紧密连接蛋白起到维持和重排作用。我们找到了AMPK的相互作用蛋白SHP-2和CBS等，考察这些信号分子在组织局部的分布和表达情况；并在炎症发生和炎症细胞激活的过程中观察它们的激活和功能变化。最后，本课题通过细胞外体系考察分子间相互作用：使用计算机模拟fraxinellone与AMPK-γ的结合模式；构建fraxinellone的一系列结构类似物：CD01，CD02，CD03和CD04等；发现fraxinellone和obaculactone能够竞争AMPK-γ与CBS的结合；计算机模拟fraxinellone与AMPK-γ的氨基酸突变后结合力的docking计算；并发现化合物fraxinellone与AMPK-γ的结合具有特异性，它与AMPK-alpha1，AMPK-alpha2，AMPK-beta，IFN-γR无结合作用。此外，为了阐明fraxinellone对其它免疫性疾病的治疗作用及其意义，本课题还考察了fraxinellone对小胶质细胞、肠上皮细胞、肝星状细胞及其介导的疾病的治疗效应。本项目已发表SCI论文15篇，其中包括nature communication等在内影响因子大于5的有4篇。并获授权中国专利1项。