基于比较基因组学方法的沙门氏菌血清分型分子靶点的发掘及其基因的功能分析

针对沙门氏菌血清分型目前普遍采用的血清学鉴定方法费时费力的现状，采用自主建立的基于比较基因组学的生物信息学发掘平台和生物学验证方法，筛选沙门氏菌某一血清型的特异基因片段作为分子靶点，建立沙门氏菌血清分型的分子方法；同时通过基因缺失和超量表达该血清型特异基因，比较突变株在血清型、毒力及生化特征等方面与野生株的差异，以鉴定该血清型特异基因的功能，揭示该基因之所以具有血清型特异性的原因，初步形成沙门氏菌血清型与基因型关系的假说。这一研究项目的完成，还将获得具有我国自主知识产权的沙门氏菌血清分型检测靶点及其分子分型方法，为沙门氏菌流行病学研究、食品安全风险评估与预警提供技术支持。

针对沙门氏菌血清分型目前普遍采用的血清学鉴定方法费时费力的现状，本项目建立了基于比较基因组学方法的沙门氏菌血清分型分子方法，具体过程如下：从公共数据中下载了沙门氏菌的全基因组序列，按照不同的血清型（血清组）进行分类，形成了沙门氏菌基因组本地数据库；利用高通量特异性靶点发掘系统——SMM-system，以沙门氏菌血清组A、B、C1、C2和D以及8种常见血清型菌株（伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、婴儿沙门氏菌以及鸡沙门氏菌）为研究对象，比较沙门氏菌不同血清组间和血清型间的基因组序列，分别发掘到血清组A-D特异检测靶点32个和8种血清型的特异检测靶点60个；以上述特异检测靶点DNA序列为模板，筛选出检测性能最佳（特异性最强、灵敏度最高）的引物对，建立了检测这些血清型（血清组）的多重PCR体系；使用该多重PCR检测体系，检测了153株标准菌株和分离株，并与血清学鉴定的结果进行了比较，结果显示，两种方法有着很好的符合率（Kappa值>0.80）；采用人工污染食品样品的方法，评价了血清型（血清组）多重PCR检测体系在实际食品样品中的检测特异性和灵敏度，结果使用血清型（血清组）多重PCR检测体系，初始人工污染量≤5 cfu/10mL的牛乳样品中，只需增菌12h均可以检测出阳性结果；血清组特异基因为糖基转移酶基因、膜蛋白基因和纤毛鞭毛合成相关基因，它们参与了糖基代谢合成以及转移、运输，对于O抗原的形成起着重要作用；血清型特异基因主要是来自于噬菌体/质粒相关基因、转移元件以及分泌蛋白等毒力基因，它们与沙门氏菌适应自然与宿主环境变化有关；利用同源重组的方法，构建了无标记的沙门氏菌血清组特异基因的缺失突变体（△wzxC1，△SC0368，△SC0595与△SC0368△SC0595）；先后使用pTrc99A和pET32a载体，分别构建了过量表达突变株，通过细胞抗原（O7）与鞭毛抗原（HC）玻片凝集实验，分析了缺失突变株的血清型改变情况，实验结果表明：特异检测靶点对应基因的缺失，不同程度的影响了细胞抗原和（或）鞭毛抗原的合成和表达；从生长状态、细胞壁的结构变化、运动性与菌膜形成能力等方面，测定了沙门氏菌血清组特异基因缺失突变株与野生株的生化特征差异，确定了基因功能并推测了其在血清型形成过程中可能发挥的作用。