基于质谱多反应监测技术的高通量,高灵敏的血清生物标志物定量确证技术的发展与应用

生物标志物的研究是医学领域关注的热点。尽管蛋白质组学技术的发展推动了生物标志物发现环节的进度，但在定性定量确证环节却由于基于免疫学原理的技术的限制，使得整个研究流程出现了瓶颈。质谱多反应监测（MRM）技术的定量检测方法在蛋白质组学领域的应用，为解决上述问题带来了希望。然而在分析血清等体液样本中仍受到来自方法学上的挑战。质谱分析技术很难跨越高低丰度蛋白质产生的动态范围，检测到ng/mL级的生物标志物。MRM技术还需要进一步发展，实现高通量和高灵敏度检测，满足血清等复杂生物样本中蛋白质的分析需求。本项目将在已建立的MRM定量检测技术基础上，发展快速富集方法提高MRM检测灵敏度，发展规模化的定量多肽选择和参数优化流程增加MRM分析通量，建立低丰度生物标志物候选蛋白质的高通量规模化确证平台，突破目前低丰度蛋白质的分析限制，为临床提供更实际和更有价值的生物标志物。

按照申请项目内容，完成如下研究工作：首先建立并优化了免疫亲和富集MRM检测方法，通过将抗体结合于CNBr活化材料上，实现了对血清中低丰度靶标蛋白质甲胎蛋白（AFP）的快速富集检测。血清标准曲线实验结果显示，本研究能实现血清中12.2ng/mL靶标蛋白质核心岩藻糖化肽段的MRM定量检测，相对标准偏差为5%。其次，优化了MRM定量方法的各个步骤，1）创新性地将金属标记技术与质谱多反应监测技术（MRM）相结合，价廉易得的双功能试剂和镧系金属元素可用于蛋白质MRM定量研究；2）建立了定量肽段串联体蛋白质(concatamers of Q peptides，QconCATs) 结合18O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法，解决了质谱MRM技术大规模同位素标记肽段制备获得困难的问题；3）发展了固定化胰酶替代溶液胰酶，增加酶切效率，降低酶切反应时间从12h以上至2min，减低了MRM样品制备所需时间；4）建立了质谱智能选择反应监测（intelligent SRM, iSRM）技术，能有效用于定量肽段母子离子对检测的快速确证，增加MRM检测的特异性；5）发展了色谱保留时间依赖-MRM扫描方法，提高单位时间MRM扫描效率,可检测肽段数量提高40%以上，增加了质谱扫描通量。最后，在以上技术的支持下，规模化进行了血清中生物标志物候选蛋白质的验证。对临床收集到的15例肝硬化患者血清和22例肝癌患者血清，采用免疫亲和富集结合MRM的方法检测了肝癌组和肝硬化组中甲胎蛋白8种特征糖肽与非糖肽的比率，结果显示其中G6，五糖核心外的糖链为LacNAc+ sialyl LacNAc，最有可能成为我们下一步区分肝癌和肝硬化的肝癌标志物，另外，肝硬化组发生的核心岩藻糖化显著低于肝癌组，利用特异酶切后的简化糖肽同非糖肽的比值也有可能成为新的区分肝癌和肝硬化患者的检测标准。